紫蘇二酰甘油酰基轉移酶基因（PfDGAT1）鑒定及表達分析

周雅莉，任文燕，郝月茹，安 茜，段露露，李潤植，王計平

（1.山西農業大學農學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學分子農業與生物能源研究所，山西 太谷 030801）

紫蘇（Perilla frutescens（L.）Britt.），唇形科紫蘇屬，為1年生草本植物[1]，是一種具有廣泛開發利用前景的經濟作物，是我國衛生部首批頒布的既是藥品又是食品的60 種“藥食同源”植物之一[2]，被廣泛用作中藥材和蔬菜、調味品等[3]。紫蘇種子中含油量可達 35%～64%，而 ω-3 脂肪酸（C18∶3）和 ω-6脂肪酸（C18∶2）含量分別高達54%～64%和14%，是目前所發現的C18∶3 脂肪酸含量最高的特殊油料作物之一[4-7]。

二酰甘油酰基轉移酶（Diacylgycerol acyltransferase，DGAT）是三酰甘油（Triacylglycerol，TAG）合成的關鍵酶和限速酶，主要催化二酰甘油加上脂肪酸酰基生成三酰甘油[8]。對于大多數油料作物種子的TAG 合成積累具有重要作用。有研究發現，油料植物在其種子發育過程中，隨著DGAT 酶活性不斷加強油脂積累速度加快，而當油脂含量趨于穩定時，DGAT 活性會逐漸降低[9]。KUBIS 等[10]研究發現，在大豆（Glycine max）高油和低油品種中，大豆種子油脂積累速度、油脂含量均與DGAT 酶的活性呈正相關。HOBBS 等[11]首先在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆得到DGAT1 基因，且該基因的cDNA 在擬南芥中僅存在一個拷貝。隨后，人們相繼在油菜（Brassica napus）[12]、煙草（Nicotiana tabacum）[13]、大豆[14]、蓖麻 （Ricinus communis）[15]、旱金蓮（Tropaeolum majus）[16]和玉米（Zea mays）[17]等植物中克隆得到DGAT1 基因。

本研究依據紫蘇轉錄組數據庫，從晉紫蘇1 號中克隆得到PfDGAT1 基因全長序列，并分析該基因在紫蘇不同組織中的表達特性，旨在為進一步研究PfDGAT1 基因在紫蘇等油料作物油脂合成代謝過程中的作用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試紫蘇品種晉紫蘇1 號種植于山西農業大學農學院試驗站。取不同組織器官及不同發育時期（開花后 10，20，30，40 d）的種子，液氮速凍后 -80 ℃保存備用。大腸桿菌DH5α 感受態與試驗所用克隆載體pMD18-T 均保存于山西農業大學分子農業與生物能源研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因克隆 利用EASYspin RNA 提取試劑盒（RN09，艾德萊生物）提取晉紫蘇1 號葉片總RNA，參考ABM 公司反轉錄試劑盒（5X All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit））方法進行反轉錄，得到cDNA 用于后續試驗。依據GeneBank 中紫蘇 PfDGAT1 基因序列（AF298815.1）設計擴增全長cDNA 的引物PfDGAT1-F/R 進行PCR 擴增（表1）。反應體系為20μL：模板cDNA2μL，上下游引物各 0.5 μL，10×Pfu Buffer 2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，Pfu DNA Polymerase 0.5 μL，dd H2O 12.9 μL。反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸2 min，循環 30 次；72 ℃終延伸 5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR 擴增產物純化回收并連接到pMD18-T 載體上，轉入大腸桿菌感受態細胞DH5α中，鑒定陽性克隆，送至通用生物公司（安徽）測序。

1.2.2 PfDGAT1 基因生物信息學分析 利用NCBIORF（Open Reading Frame，ORF）在線軟件對 1.2.1獲得的基因序列的開放閱讀框進行識別，并將核酸、氨基酸進行比對[18]。利用在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）對該蛋白質的基本理化性質進行分析；使用PSORTII（http:// psort.hgc.jp/form2.html）軟件對該蛋白質進行亞細胞定位預測；運用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線軟件分析該蛋白質的跨膜區域，通過SOPMA（http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_autom at.pl?page=npsa_sopma.html）對其二級結構進行預測；利用NCBI-CDD（http://ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/Wrpsb.cgi）預測該蛋白的功能結構域；采用SWISSMODEL（http://swissmodel.expasy.org/）在線軟件對該蛋白進行三維結構分析與建模。運用在線軟件PRALINE（http://www.ibi.vu.nl/programs/praline-www/）對紫蘇DGAT1 蛋白與其他已公布的植物蛋白質進行多序列比對，從中找出保守域。運用MEGA 7.0 多序列比對軟件對紫蘇DGAT1 蛋白與其他多種高等植物氨基酸序列進行比對，并構建系統進化樹。

1.2.3 實時熒光定量PCR 檢測 提取晉紫蘇1 號的根、莖、葉、花及不同發育時期（開花后10，20，30，40 d）種子的總RNA，反轉錄成cDNA。根據紫蘇PfDGAT1 基因的cDNA 序列設計熒光定量PCR 特異性引物PfDGAT1-q-F/R，以紫蘇18S rRNA（表1）作為內參基因[19]設計引物18S rRNA-F/R，用于實時熒光定量PCR 檢測。熒光定量PCR 反應體系為10 μL：cDNA 模板 0.5 μL，EvaGreen 2X qPCR MasterMix 5 μL，正反引物各 0.3 μL，ddH2O 3.9 μL。擴增程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 60 s，40 次循環；65 ℃ 5 s，95 ℃ 15 s。每個樣品進行 3 次生物學重復和3 次技術重復。采用2-ΔΔCt法計算紫蘇PfDGAT1 基因的相對表達量[20]。

表1 引物信息

1.3 數據分析

試驗數據采用SPSS 軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 紫蘇PfDGAT1基因全長cDNA序列的克隆

以晉紫蘇1 號葉片cDNA 作為模板進行RTPCR 擴增，擴增產物電泳結果如圖1所示，RT-PCR反應擴增得到1 條長度約為1 964 bp 的目的條帶，與預期相符。將編碼區序列與GeneBank 中紫蘇PfDGAT1 基因（AF298815.1）序列進行比對，結果表明，推測的氨基酸序列與已公布PfDGAT1 基因序列（AF298815.1）無差異，說明分離獲得了正確的PfDGAT1 基因的 cDNA 克隆。

2.2 PfDGAT1基因的生物信息學分析

本試驗克隆獲得PfDGAT1 基因序列全長為1 964 bp，開放閱讀框（ORF）長度為 1 605 bp（核苷酸序列位于69～1 673），共編碼534 個氨基酸殘基（圖2）。通過ProtParam 軟件預測分析表明，PfDGAT1蛋白的分子式為C2812H4322N714O747S35，相對分子質量為61.21 ku，理論等電點（pI）為8.34，不穩定系數為46.77，親水性系數為0.227，推導該蛋白質為疏水性不穩定蛋白。經PSORTII 亞細胞定位預測分析顯示，紫蘇PfPDAT1 蛋白定位于質膜的可信度為65.2%，預測其為膜錨定蛋白。

通過TMHMM 在線分析紫蘇PfDGAT1 蛋白跨膜區域，結果顯示（圖3），PfDGAT1 蛋白有 9 個典型的跨膜螺旋區，分別位于139～158，182～201，213～235，240～262，328～350，376～398，438～460，470～492，505～527 位氨基酸之間。通過NCBI-CDD數據庫分析發現，PfDGAT1 蛋白具有PLN02401（diacylglycerolo-acyltransferase）結構域，屬于MBOAT超家族中的成員。

運用SOPMA 在線軟件對紫蘇PfDGAT1 蛋白的二級結構進行預測分析，結果顯示，該蛋白二級結構的主要結構元件為α-螺旋（43.63%）和無規則卷曲（41.76%），β-轉角（2.81%）和延伸鏈（11.80%）則分散于整個結構中。使用SWISS-MODEL 在線軟件對PfDGAT1 蛋白進行三維結構分析與建模，結果如圖4所示。

通過對紫蘇PfDGAT1 蛋白與其他植物DGAT1蛋白進行多序列比對發現，紫蘇PfDGAT1 蛋白與其他植物蛋白一樣，具有9 個典型的結構域，分別是酰基輔酶A 結合位點、擬南芥突變體AS11 串聯重復序列、催化活性位點、磷酸泛酰巰基乙胺附著位點、蛋白激酶1 靶標位點、硫酰基酶中間體結合位點、脂肪酸結合蛋白標簽、甘油二酯結合位點、內質網定位保守域。系統進化樹分析結果顯示（圖5），紫蘇PfDGAT1 蛋白與芝麻、油橄欖的親緣關系較近，且序列同源性分別為89%，83%，與大豆和鷹嘴豆的親緣關系較遠，表明DGAT1 蛋白在進化上具有高度保守性。

2.3 紫蘇PfDGAT1基因表達特性分析

利用熒光定量PCR 技術分析紫蘇PfDGAT1 基因在晉紫蘇1 號根、莖、葉、花及不同發育時期種子中的表達特性，結果表明（圖6），PfDGAT1 基因在紫蘇不同組織中均有表達，在種子中表達量最高，在莖和花中的表達量次之，在根中基本不表達，且隨種子發育該基因表達量呈先升高后降低的變化趨勢，且在開花后20 d 達到最高。以根為對照，PfDGAT1 基因在莖、葉、花中的表達量分別是根中的 11.82 倍、1.77 倍和 8.57 倍，在開花后 20 d 的種子中該基因的表達量是根中表達量的36.29 倍。

3 結論與討論

二酰甘油酰基轉移酶（DGAT）是TAG 合成最后一步反應的關鍵限速酶，有研究表明，植物DGAT1 蛋白一般具有 9～10 個跨膜結構域[13，21]。本研究使用含油量較高的紫蘇品種晉紫蘇1 號作為試驗材料，克隆獲得PfDGAT1 基因后，分析該基因序列特征及編碼蛋白基本性質，結果發現，紫蘇PfDGAT1 蛋白具有9 個典型的跨膜螺旋區，這與前人研究結果一致[21]。多序列比對結果發現，PfDGAT1蛋白具有酰基輔酶A 結合位點、擬南芥突變體AS11 串聯重復序列、催化活性位點、磷酸泛酰巰基乙胺附著位點、蛋白激酶1 靶標位點、硫酰基酶中間體結合位點、脂肪酸結合蛋白標簽、甘油二酯結合位點、內質網定位保守域等9 個功能結構域，這與 HOBBS 等[11]，ZOU 等[22]，HE 等[23]，BOUVIER 等[13]，NYKIFORUK 等[24]對植物DGAT1 蛋白功能位點預測結果一致。

MURPHY 等[25]研究發現，DGAT 廣泛分布于植物的各個組織中，其活性在植物的花及發育的種子中最高。本試驗利用熒光定量PCR 分析PfDGAT1基因在紫蘇不同組織器官中的表達特性，結果顯示，PfDGAT1 基因在紫蘇不同組織中均有表達，其中，在種子中表達量最高，在莖和花中的表達量次之，在根中基本不表達，且隨種子發育，該基因表達量呈現先升高后降低的變化趨勢。王計平等[19]研究發現，在紫蘇種子發育過程中，其總脂肪酸含量逐漸升高，且PfDGAT1 基因表達量先升高后下降，與本研究結果基本一致，表明PfDGAT1 基因在紫蘇脂肪酸合成積累中發揮重要作用。

本研究克隆得到紫蘇PfDGAT1 基因cDNA，該序列全長 1 964 bp，其中，CDS 為 1 605 bp，共編碼534 個氨基酸，預測PfDGAT1 基因編碼定位于細胞質膜，具有典型的DGAT1 功能結構域，包含9 個典型的跨膜螺旋區。多序列比對和系統進化樹分析結果表明，PfDGAT1蛋白與芝麻、油橄欖的DGAT1 蛋白的親緣關系較近。qRT-PCR 結果表明，PfDGAT1基因在紫蘇根、莖、葉、花及種子發育不同階段均有表達，且在種子中表達量最高，PfDGAT1 基因表達量隨種子發育呈先升高后降低的變化趨勢。