HPLC 法測定新疆軟紫草屬4 種植物根中萘醌類成分

丁文歡， 燕雪花， 葛 亮， 徐海燕?

（1. 新疆醫科大學中心實驗室， 新疆 烏魯木齊 830054； 2. 新疆醫科大學中醫學院， 新疆 烏魯木齊 830054）

《中國藥典》 中紫草來源于紫草科軟紫草屬植物新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst.、 黃花軟紫草Arnebia guttata Bunge 的干燥根[1］， 為新疆道地藥材， 被譽為“涼血之圣藥”[2］， 主要活性成分為萘醌色素類——紫草素及其衍生物， 其含有量對于考量藥材品質而言尤為重要， 這類物質主要有抗炎、 抗菌、 抗病毒、 抗癌、 保護腎臟、 抑制細胞色素等作用[3-11］， 測定方法包括分光光度法、 薄層掃描法、 高效液相色譜法、 電化學法[12-21］。 受藥材來源、傳統民族醫藥藥用習俗等影響， 紫草在市場上出現魚目混雜的現象， 市售紫草無論源自新疆或國外， 其正品均源于軟紫草屬， 該屬共約25 種， 分布在新疆的有新疆紫草A．euchroma、 黃花軟紫草A． guttata、 天山軟紫草A． tschimganica、 硬萼軟紫草A． decumbens、 紫筒花A． obovata[22］， 天山軟紫草、 硬萼軟紫草雖未被《中國藥典》 收錄， 但其性狀特征顯示， 2 種植物的根分別與新疆紫草、 黃花軟紫草相似， 均呈現紫紅色， 推測可能含有紫草素， 但未見有關其具體成分及含有量的報道。 本研究測定了新疆紫草、 黃花軟紫草、 天山軟紫草、 硬萼軟紫草4 種植物根中7 種萘醌類成分的含有量， 為擴大該植物新藥源提供了參考。

1 材料

1.1 儀器 MS105DU 型電子天平（十萬分之一， 瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ5200DE 型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試藥 β， β′-二甲基丙烯酰紫草素（15102821）、 左旋紫草素（15102721）、 去氧紫草素（15062422）、 乙酰紫草素（15120431） 對照品由上海同田生物技術有限公司提供； β-乙酰氧基異戊酰紫草素（P05M7F14235） 由上海源葉生物技術有限公司提供； 異丁酰紫草素（wkq16101302）由四川省維克奇生物科技有限公司提供； 2-甲基丁基酰紫草素（AV51-LDQR） 由日本化成工業株式會社提供。 乙腈、 甲酸為色譜純； 石油醚（60～90 ℃） 為分析純； 水為艾科超純水。

1.3 樣品 藥材采自新疆， 由新疆醫科大學中藥資源教研室徐海燕副教授鑒定為紫草科軟紫草屬新疆紫草Arnebiaeuchroma （采自霍城）； 黃花軟紫草Arnebia guttata （采自阿圖什）； 天山軟紫草Arnebia tschimganica （采自和靜）； 硬萼軟紫草Arnebia decumbens （采自昌吉） 的干燥根， 粉碎過4 號篩， 備用。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 分別取左旋紫草素、 乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、 去氧紫草素、 異丁酰紫草素、β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、 2-甲基丁基酰紫草素對照品2、 10、 10、 1、 10、 5、 25 mg， 置25 mL 量瓶中， 乙腈定容， 得貯備液。 分別取除2-甲基丁基酰紫草素外其余6 種貯備液適量， 置同一10 mL 量瓶中； 取2-甲基丁基酰紫草素貯備液3.5 mL， 置10 mL 量瓶中， 即得。

2.2 供試品溶液制備 取藥材粉末約1.0 g， 精密稱定，置錐形瓶中， 加入石油醚（60～90 ℃） 50 mL， 稱定質量，超聲30 min， 冷卻， 石油醚（60 ～90 ℃） 補足減失質量，過濾； 量取續濾液（新疆紫草10 mL， 黃花軟紫草、 天山軟紫草、 硬萼軟紫草各30 mL）， 蒸干， 殘渣加乙腈溶解，轉移至10 mL 量瓶中， 乙腈定容至刻度， 搖勻， 即得。 色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.3 色 譜 條 件[1，23］Agilent-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）， 流動相乙腈-0.05% 甲酸 （70 ∶30）； 體積流量1 mL／min； 檢測波長275 nm； 柱溫30 ℃； 進樣量10 μL。

2.4 線性關系考察 精密吸取除2-甲基丁基酰紫草素外其余6 種貯備液適量， 置5 個10 mL 量瓶中， 乙腈定容并混勻； 精密吸取2-甲基丁基酰紫草素貯備液0.1、 2.0、 4.0、6.0、 8.0 mL， 置5 個10 mL 量瓶中， 乙腈定容并混勻。 分別吸取各質量濃度對照品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下測定， 以峰面積為縱坐標（Y）， 質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸， 結果見表1， 可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.5 精密度試驗 取供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下連續進樣6 次， 測得7 種萘醌類成分峰面積RSD 分別為0.35%、 0.22%、 0.53%， 1.70%、 0.28%、 0.45%、0.24%， 表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下于0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 24 h 測定， 測得7 種萘醌類成分峰面積RSD 分別為1.52%、 0.45%、 1.27%、 1.84%、0.70%、 1.12%、 0.48%， 表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 取藥材粉末6 份， 精密稱定， 按“2.2”項下方法制備供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下測定，測得7 種萘醌類成分含有量RSD 分別為1.67%、 1.99%、1.84%、 1.02%、 2.05%、 1.92%、 2.07%， 表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 以乙腈為溶劑配制圖1 中1 ～6 成分的對照品溶液， 質量濃度分別為0.161、 3.040、 1.332、0.160、 1.761、 1.034 mg／mL。 取 藥 材 粉 末12 份， 每 份0.25 g， 精密稱定并置錐形瓶中， 其中6 份分別加入以上對照品溶液1.0 mL， 另外6 份分別精密加入4.000 mg／mL 2-甲基丁基酰紫草素對照品溶液1.0 mL， 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下測定， 測得回收率 （RSD） 分別為99.75% （0.42%）、 99.17%（0.92%）、 99.12%（0.71%）、 98.63% （1.94%）、 97.37%（1.64%）、 99.07% （0.70%）、 98.37% （1.08%）。

2.9 樣品含有量測定 取4 種樣品各3 份， 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下測定，計算含有量， 結果見表2。

表2 各成分含有量測定結果（mg／g）

4 種軟紫草屬植物根中均含有萘醌類成分， 不同種間存在差異。 在“2.3” 項色譜條件下， 新疆紫草的萘醌類成分總量最高， 為46.745 5 mg／g， 其次是黃花軟紫草， 含有量最低的為硬萼軟紫草， 為17.331 4 mg／g， 推測可能是硬萼軟紫草為一年生草本植物， 其余幾種均為多年生草本植物， 各成分在植物體內的蓄積不同。 新疆紫草、 黃花軟紫草均含有7 種成分， 天山軟紫草檢測到除去氧紫草素外的6 種成分， 硬萼軟紫草未檢測到β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、 β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧。 2015 年版《中國藥典》規定， 紫草中含β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧不得少于0.30%， 本研究發現新疆紫草、 黃花軟紫草及天山軟紫草中該成分均符合藥典規定。 7 種萘醌類成分中， 各基源軟紫草中分布情況不同， 可作為藥典收錄品種與其他非收錄品種間的鑒別依據。

3 討論

因2-甲基丁基酰紫草素含有量僅為88.0%， 從色譜圖中可以看出它會對其他6 種待測成分產生干擾， 故本研究中該成分的線性關系考察、 加樣回收率試驗均單獨進行。

本研究采用HPLC 法同時測定4 種軟紫草屬植物根中7種成分含有量， 方法簡單快速， 重復性好， 結果穩定可靠。《中國藥典》 僅對β， β′-二甲基丙烯酰阿卡寧進行定量分析， 而本研究同時測定7 種萘醌類成分， 可提高藥材質量標準， 能用于紫草及同屬其他植物的鑒別及質量評價。

然而， 本實驗每種紫草僅測定了一批樣品， 對幾種紫草中各成分含有量的高低尚不能得出定論。 若要比較其差異， 則需要擴大樣本量， 考察不同生長期、 生長環境的影響， 以期為紫草質量控制及擴大新藥源提供參考依據。