重樓解毒酊微生物限度檢查方法適用性探討

滕 鈺， 徐 洪， 鄒 莉， 李 琴， 羅 曼， 王 俊?

（1. 貴州省食品藥品檢驗所， 貴州 貴陽 550004； 2. 貴州圣濟堂制藥有限公司， 貴州 貴陽 551400）

重樓解毒酊屬于獨家批文品種， 是根據傳承千年的苗族驗方采用現代工藝研制而成， 主要成分有重樓、 艾葉、石菖蒲等， 具有清熱解毒、 散瘀止痛功效[1］， 臨床用于肝經火毒所致帶狀皰疹、 皮膚瘙癢、 蟲咬皮炎、 流行性腮腺炎[2］， 收載于國家食品藥品監督管理局國家中成藥地方標準上升國家標準（皮膚科分冊）。 微生物限度檢查是藥品質量控制非常重要的一部分[3］， 本研究結合供試品特性、給藥途徑及限度要求， 依據2015 年版 《中國藥典》 四部[4］對重樓解毒酊進行了微生物限度檢查方法適用性研究， 從而保障檢驗結果的準確性和有效性， 提高用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 樣品 重樓解毒酊， 規格45 mL／瓶， 批號20170101、20170102、 20170103， 均由貴州圣濟堂制藥有限公司提供。

1.2 培養基及試劑 胰酪大豆胨液體培養基（TSB） （批號17032950）、 沙氏葡萄糖液體 培養基 （SDB） （批號150916）、 甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號1610083）、 胰酪大豆胨固體培養基（TSA） （批號1703254）、 沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA） （批號17031651）、 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號1512232）， 均購于北京陸橋技術股份有限公司。 聚山梨酯80 （批號2014112601， 成都市科龍化工 試 劑 廠）； pH7.0 氯 化 鈉-蛋 白 胨 緩 沖 液 （批 號3105593， 廣東環凱微生物科技有限公司）。

1.3 菌種 白色念珠菌[CMCC （F） 98001］、 金黃色葡萄球菌[CMCC （B） 26003］、 枯草芽孢桿菌[CMCC （B）63501］、 銅綠假單胞菌 [CMCC （B） 10104］、 黑 曲霉[CMCC （F） 98003］ 均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.4 儀器 電子天平[型號PL602-L， 梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； 電熱恒溫水浴鍋（型號DK-98-Ⅱ， 天津泰斯特儀器有限公司）； 低溫培養箱、 恒溫培養箱（型號BF240， 德國Binder 公司）； 生物安全柜 （型號BSC-1300ⅡA／B3， 新加坡藝思高科技有限公司）； 集菌儀（型號HTY-601， 浙江泰林生物技術股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 按2015 年版《中國藥典》 四部要求制備[4］，并參考劉康連等[5］報道的方法。 用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌、 銅綠假單胞菌、 白色念珠菌分別制成濃度不大于10 000、 1 000 cfu／mL 的菌懸液， 將黑曲霉分別制成濃度不大于10 000、 1 000 cfu／mL的孢子懸液， 備用。

2.2 供試品溶液制備 取本品10 mL， 加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL[4］， 置40 ℃水浴中振搖混勻，即得（1 ∶10）。

2.3 回收比值 計數法適用性試驗回收比值[6］= （試驗組菌落數-供試品對照組菌落數） ／菌液組菌落數， 計算結果在0.5～2 范圍內時， 表明方法可行[7］。

2.4 計數法適用性

2.4.1 試驗組

2.4.1.1 平皿法 向7 份供試品溶液（每份10 mL） 中加入濃度不大于l0 000 cfu／mL 的“2.1” 項下菌液（需氧菌計數對應金黃色葡萄球菌、 枯草芽孢桿菌、 銅綠假單胞菌、白色念珠菌、 黑曲霉， 霉菌和酵母菌計數對應白色念珠菌、黑曲霉） 各0.1 mL， 混勻， 使每1 mL 供試品溶液含菌量不大于100 cfu， 取1 mL 注入90 mm 無菌培養皿中， 傾注20 mL 45 ℃左右融化的培養基（需氧菌計數平皿加TSA，霉菌和酵母菌計數平皿加SDA）， 迅速混勻， 冷卻凝固。

2.4.1.2 薄膜過濾法 向7 份供試品溶液（每份10 mL）中加入濃度不大于l 000 cfu／mL 的“2.4.1.1” 項下5 株菌液各0.1 mL， 混勻， 使每1 mL 供試品溶液含菌量不大于10 cfu， 全部過濾， 用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗10 次（每次100 mL）， 將濾膜面朝上貼于預制平板上（需氧菌計數對應TSA， 霉菌和酵母菌計數對應SDA）。 2種方法均每株菌平行制備2 個平皿， 按藥典規定條件培養并計數。

2.4.2 菌液對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品溶液， 按“2.4.1” 項下方法操作[8］。

2.4.3 供試品對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代菌液， 按“2.4.1” 項下方法操作[8］。

2.4.4 陰性對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品溶液， 不加試驗菌， 其他操作同“2.4.1” 項[6］。

2.4.5 不同計數法比較 采用平皿、 薄膜過濾法的回收比值（均取2 位有效數字）， 見表1。 5 種試驗菌7 個試驗組的回收比值均在0.5～2 范圍內， 表明本品對金黃色葡萄球菌、 銅綠假單胞菌、 白色念珠菌、 黑曲霉生長均有一定抑制作用； 其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強， 采用平皿法時， 其回收比值已接近范圍下限0.5。 另外， 采用薄膜過濾法時5 株菌回收比值均有不同程度的提高， 表明該方法更能消除該品種的抑菌活性。

表1 不同計數法適用性試驗結果

2.5 控制菌檢查方法適用性

2.5.1 金黃色葡萄球菌

2.5.1.1 試驗組 常規法為取供試品溶液10 mL， 接種至100 mL TSB 培養基， 加入金黃色葡萄球菌 （不大于100 cfu／mL） 混勻， 34 ℃下培養18 h， 取其培養物劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養基， 34 ℃下培養18 h[4］， 觀察結果； 稀釋法為在200 mL TSB 培養基中加入10 mL 供試品溶液， 其他操作同常規法。

2.5.1.2 供試品對照組 不加試驗菌， 增菌培養時間為24 h，選擇、 分離培養時間為72 h[4］， 其他操作同“2.5.1.1” 項。

2.5.1.3 陰性對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品， 其他操作同“2.5.1.2” 項。

2.5.2 銅綠假單胞菌

2.5.2.1 試驗組 常規法為取供試品溶液10 mL， 接種至100 mL TSB 培養基， 加入銅綠假單胞菌（不大于100 cfu／mL）混勻， 34 ℃下培養18 h， 取其培養物劃線接種至溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基， 34 ℃培養18 h[4］， 觀察結果； 稀釋法為在200 mL TSB 培養基中加入10 mL 供試品溶液， 其他操作同常規法。

2.5.2.2 供試品對照組 不加試驗菌， 增菌培養時間為24 h，選擇、 分離培養時間為72 h[4］， 其他操作同“2.5.2.1” 項。

2.5.2.3 陰性對照組 取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品， 其他操作同“2.5.2.2” 項。

2.5.3 控制菌檢查方法適用性 當TSB 體積為200 mL 時，試驗組能檢出相應陽性對照菌， 見表2， 表明用培養液稀釋法（TSB 200 mL） 能消除該品種對金黃色葡萄球菌、 銅綠假單胞菌的抑菌作用。

表2 控制菌檢查方法適用性試驗結果

3 討論

在對重樓解毒酊進行微生物檢查方法適用性研究時主要存在2 個問題， 一方面由于該制劑中含有艾葉、 石菖蒲、重樓等多種抑菌成分[9-17］， 對藥典要求的多株菌生長均有抑制， 采用常規平皿法進行微生物計數時， 回收比值偏低，抑菌活性消除不理想， 可能會導致假陰性結果出現， 不能真實反映制劑微生物污染狀況； 另一方面雖然該品種對白色念珠菌和黑曲霉的抑制性不強， 但其為皮膚用藥， 2015年版《中國藥典》 對該類制劑微生物限度標準規定嚴格，尤其是霉菌和酵母菌總數為10 cfu／mL[4］， 故計數若采用平皿法或培養基稀釋法， 會不利于企業內控標準制定和微生物安全質量控制。

2015 年版《中國藥典》 中， 計數法部分消除樣品抑菌性的主要技術手段為培養基稀釋法、 薄膜過濾法、 添加中和劑[18］， 后者通常是與前兩者聯用。 薄膜過濾法直接過濾抑菌成分， 消除抑菌活性， 能有效避免假陰性結果出現，常用于檢測中藥液體制劑[19］， 此方法還有快速收集菌種、減少檢測時間的優點[20］， 但不適用于非完全溶解的供試品[21］； 培養基稀釋法雖對藥品中抑菌成分進行稀釋， 但沒有完全消除， 在計數檢測過程中抑菌成分仍可能對菌的生長不利， 進而對回收率和檢出率造成影響[22］。 據報道[23］，高稀釋級供試品會降低微生物檢出， 同時增加試驗步驟，延長試驗時間， 增加污染風險， 對結果準確性的不利影響增多， 《中國藥典》 對皮膚、 耳用、 口腔黏膜給藥制劑的微生物計數限度要求比口服固體制劑高， 而上述制劑通常為液體制劑。 因此， 在限值要求較高， 樣品藥渣少、 溶解性好、 通過性佳的情況下， 薄膜過濾法是消除藥品抑菌活性的合適方法。

2015 年版《中國藥典》 將“方法驗證” 改成了“方法適用性”， 更側重于將試驗條件、 供試品特性等因素作為一個整體系統來評價， 控制分析條件對諸因素的影響，使檢測活動能達到預期目的[23-24］。 本研究以此為宗旨， 結合重樓解毒酊的抑菌成分、 理化特性和限度標準， 選擇薄膜過濾法作為計數法， 既提高了回收比值， 又保證了霉菌和酵母計數法能貼合藥典限度規定， 并選擇培養基稀釋法對該品種控制菌進行檢查， 能在規定培養條件下檢出陽性菌。