補腎益元方對運動性低血睪酮大鼠HPG 軸的影響及有效成分測定

王一蓉， 周志宏， 湯長發

（1. 湖南師范大學體育學院， 湖南 長沙 410081； 2. 湖南體育職業學院， 湖南 長沙 410019）

競技體育的重要目的是要不斷提高運動成績， 如何使運動員在大負荷訓練期間提高身體機能水平、 消除疲勞是競技體育界最關心的問題， 大量研究表明， 長時間高負荷運動訓練能引起血睪酮水平下降， 進而導致體能下降、 運動能力降低或產生疲勞， 故如何防治運動性低血睪酮的發生一直是運動醫學界研究的重點領域[1-2］。 中醫理論認為，腎藏精， 主骨生髓， 為先天之本， 是體力產生的原動力和源泉， 若腎精不足， 則雄性激素分泌減少， 故補腎能促進體內雄性激素的分泌（睪酮是體內主要的雄性激素）， 從而提高機體的運動能力[3］。

補腎益元方由十余種中藥提取物組成， 具有補肝腎、強筋骨、 補氣活血、 祛風通絡功效， 方中人參大補元氣，為君藥； 淫羊藿、 女貞子、 枸杞補肝腎， 壯筋骨， 強腰膝，使“陰助陽則生化無窮”， 為臣藥； 杜仲、 黃芪補腎健脾，大伸筋草、 仙鶴草舒筋活血， 共為佐助藥， 含有人參皂苷，淫羊藿苷， 枸杞多糖等成分。 前期課題組采用該方顆粒、超微化物分別對小鼠、 大鼠、 運動員抗疲勞指標和免疫相關指標進行檢測， 取得了一定成果[4-5］； 本實驗擬創新該方劑型， 選擇11 味中藥提取物復方， 通過大鼠遞增負荷跑臺訓練方案建立運動性低血睪酮模型， 并以淫羊藿提取物為陽性對照， 觀察補腎益元中藥提取物復方對HPG 軸的影響， 研究其防治大鼠運動性低血睪酮作用的有效性和分子機制， 并比較中藥提取物復方和單味中藥提取物的干預效果， 測定方中有效成分， 為臨床開發新型運動營養補劑提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠40 只， 2 月齡， 體質量（300±10） g， 由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，湖南省動檢二站進行質量檢測， 動物生產許可證號SCXK（湘） 2013-0004， 國家標準嚙齒類B 級動物飼料飼養， 許可證號SCXK （湘） 2014-0002， 清潔級， 在干凈、 通風的環境下飼養， 自由進食飲水。

1.2 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； 匯松PW-812 全自動酶標洗板機、 匯松MB-530 多功能酶標分析儀（山東博科科學儀器有限公司）； 164-5050電泳儀（美國Bio-Rad 公司）； DYCZ-40A 轉膜儀（北京六一生物科技有限公司）， T-Gradient PCR 儀（德國Biometra公司）； PikoReal 96 熒光定量RCP 儀（美國Thermo 公司）。試劑盒均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 藥物 將補腎益元方中11 味中藥提取物（褐色粉末）混勻， 裝入膠囊， 平均粒重0.543 1 g， 由西安天一生物技術股份有限公司制作并提供。

2 方法

2.1 分組及給藥 40 只大鼠隨機分為空白組、 模型組、淫羊藿提取物組（陽性對照） 及補腎益元方低、 高劑量組， 每組8 只， 分籠飼養。 空白組大鼠常規喂養， 自由飲食， 每天灌胃4 mL 生理鹽水， 不運動； 模型組大鼠每天運動， 并于運動前1 h 灌胃4 mL 生理鹽水； 淫羊藿提取物組、 補腎益元方組每天運動， 并于運動前1 h 灌胃給藥，連續6 周。 淫羊藿提取物組給藥劑量為0.70 g／kg， 補腎益元方低、 高劑量組給藥劑量分別為0.35、 0.70 g／kg， 生理鹽水溶解藥物后配成4 mL 溶液， 其中低劑量組用量與成人持平[6］。

2.2 有效成分測定

2.2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm， 5 μm）； 流動相水（A） -乙腈（B）， 梯度洗脫，程序見表1； 檢測波長203、 270 nm； 柱溫30 ℃； 體積流量1 mL ／min； 進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg1、 Re、Rb1、 Rc、 Rb2、 Rd 及淫羊藿苷對照品適量， 加甲醇制成每l mL 分別含0.3、 0.3、 0.3、 0.3、 0.3、 0.3、 0.4 mg 上述成分的溶液， 搖勻， 即得。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取補腎益元方、 淫羊藿提取物各約0.25 g， 置于錐形瓶中， 精密加入10 mL 甲醇，稱定質量， 超聲1 h， 取出， 放冷， 甲醇補足減失的質量，搖勻， 濾過， 取續濾液， 即得。

2.3 運動性低血睪酮大鼠模型建立 采用逐級遞增負荷跑臺方案， 以血睪酮較訓練前下降15%為判斷依據[7］。 運動方案參照Bedford 在1979 年根據大鼠體質量／攝氧量回歸方程所建立的逐漸遞增速度和時間的訓練方式， 周期6 周，每周訓練6 d， 坡度保持在0°， 見表2。

表2 大鼠遞增負荷跑臺訓練方案[（m／min） ×min］

2.4 取材及指標檢測 運動組大鼠在第6 周最后1 d 進行力竭實驗， 力竭運動后不再給藥， 24 h 后腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉， 打開腹腔， 取大動脈血管血液6 mL， 其中3 mL在37 ℃下凝固后， 4 ℃、 3 000 r／min 離心10 min， 取血清， -20 ℃冰箱中保存， 用于檢測血清皮質醇、 睪酮水平。 然后， 大鼠斷頭處死， 迅速開顱取腦組織， 稱定質量后立即于1 mL 煮沸的生理鹽水中煮3 min， 再加入0.5 mL 1 mol／L冰醋酸， 置于勻漿器中勻漿， 0.5 mL 1 mol／L 氫氧化鈉中和， 4 ℃、 3 000 r／min 離心30 min， 取上清液， -20 ℃冰箱中保存， 用于檢測卵泡刺激素（FSH）、 黃體生成素（LH）、 促性腺激素釋放激素（GnRH） mRNA、 蛋白表達。

2.5 統計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理， 數據以） 表示， 組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 皮質醇、 睪酮水平 表3 顯示， 各組皮質醇水平無明顯變化（P＞0.05）。 與空白組比較， 模型組睪酮水平及睪酮／皮質醇顯著降低（P＜0.01）， 而補腎益元方高劑量組兩者顯著升高（P＜0.05）； 與模型組比較， 淫羊藿提取物組、補腎益元方組睪酮水平顯著升高（P＜0.01）。

3.2 FSH、 LH、 GnRH mRNA 表達 表4 顯示， 與模型組比較， 淫羊藿提取物組、 補腎益元方組FSH、 LH、 GnRH mRNA 表達顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）； 與補腎益元方高劑量組比較， 淫羊藿提取物組、 補腎益元方低劑量組LH mRNA 表達顯著降低（P＜0.05）， 并且后一組GnRH mRNA表達也顯著降低（P＜0.05）。＆

表3 各組皮質醇、 睪酮水平比較±s， n=8）

表3 各組皮質醇、 睪酮水平比較±s， n=8）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

空白組 187.050±48.310 1.758±0.343 108.929±36.000模型組 115.518±13.053## 1.745±0.284 67.830±14.288##淫羊藿提取物組 206.833±5.537?? 1.787±0.328 119.532±25.037??補腎益元方低劑量組 210.600±5.084?? 1.782±0.211 119.380±13.019??補腎益元方高劑量組 220.567±14.714#?? 1.786±0.167 124.257±14.789#??

表4 各組FSH、 LH、 GnRH mRNA 表達比較 s，n=8）

表4 各組FSH、 LH、 GnRH mRNA 表達比較 s，n=8）

注：與模型組比較，?P ＜0.05，??P ＜0.01；與補腎益元方高劑量組比較，＆P＜0.05

空白組 1 1 1模型組 0.522±0.145 0.824±0.161 0.347±0.085淫羊藿提取物組 1.021±0.201? 1.356±0.102??＆ 1.079±0.101??補腎益元方低劑量組 0.988±0.114? 1.299±0.105??＆ 0.781±0.061??補腎益元方高劑量組 1.223±0.086?? 1.753±0.084?? 0.991±0.052??

3.3 FSH、 LH、 GnRH 蛋白表達 表5、 圖1 顯示， 與空白組比較， 模型組FSH、 GnRH 蛋白表達顯著降低（P ＜0.01）， 淫羊藿提取物組、 補腎益元方高劑量組LH、 GnRH蛋白表達顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較， 淫羊藿提取物組、 補腎益元方組三者表達顯著升高（P＜0.01）； 與補腎益元方高劑量組比較， 補腎益元方低劑量組GnRH 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。

表5 各組FSH、 LH、 GnRH 蛋白表達比較s， n=8）

表5 各組FSH、 LH、 GnRH 蛋白表達比較s， n=8）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01；與補腎益元方高劑量組比較，＆P＜0.05

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圖1 各組FSH、 LH、 GnRH 蛋白表達

3.4 有效成分測定 圖2 顯示， 色譜峰1 ～2、 8 ～11 為人參皂苷特征峰， 外標法測得每粒復方中藥中含人參總皂苷43.57 mg； 色譜峰3～7 為淫羊藿提取物特征峰， 其中7 號峰為淫羊藿苷， 峰面積也最大， 外標法測得每粒復方中藥中含淫羊藿苷5.03 mg。

4 討論

圖2 各成分HPLC 色譜圖

研究表明， 睪酮能促進纖維和骨骼生長， 從而保持肌肉質量、 強度及骨骼密度， 并在一定條件下增強運動員運動能力和競技能力[8-9］， 但長期高負荷強度訓練使機體受到的刺激增加， 導致下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA 軸） 過度應激， 以致多個環節的功能被抑制， 從而引起運動性血睪酮降低[10-11］， 造成運動員身體機能水平下降， 運動后恢復能力下降， 甚至產生傷病。 HPG 軸調節是通過在下丘腦合成促性腺激素釋放激素（GnRH）， 經過毛細血管進入門脈血管中與受體結合， 加速卵泡刺激素（FSH）、 黃體生成素（LH） 激素釋放， 最終促進睪酮合成和分泌， 由此可知，HPG 軸活躍程度是決定睪酮分泌的最重要部分。

疲勞訓練后， 運動員出現的癥狀大多類似中醫的腎陽、腎氣虛弱， 故補腎氣、 溫腎陽中藥在抗運動性疲勞致血睪酮降低的治療中占據主導地位[12］， 其中淫羊藿能增加性腺或附屬性腺器官的臟器系數， 提高血睪酮水平， 對HPG 軸具有促進作用[13］， 其主要有效成分為淫羊藿苷。 因此， 本實驗選擇補腎益元方， 以方中臣藥淫羊藿提取物為陽性對照， 經過6 周遞增負荷跑臺大強度運動訓練后發現， 與空白組比較， 模型組大鼠HPG 軸FSH、 LH、 GnRH 激素mRNA、 蛋白表達較低， 血清T 水平也明顯下降（P＜0.01），并且LH mRNA、 蛋白表達略微下降， 但不明顯， 這與黃文聰[14］提到的長期訓練運動量變化對LH 水平并無大影響，但長期耐力訓練會引起其生物活性下降的觀點基本一致；給予中藥提取物復方后， 大鼠HPG 軸中FSH 激素mRNA、蛋白表達較模型組升高， 但淫羊藿提取物及補腎益元低、高劑量組之間無明顯變化； 給藥組LH mRNA、 蛋白表達也有所升高， 補腎益元方高劑量組更明顯； 補腎益元高劑量組、 淫羊藿提取物組GnRH mRNA 表達與空白組基本相當，均明顯高于補腎益元方低劑量組， 而在蛋白表達方面補腎益元低劑量組與空白組比較接近， 而補腎益元高劑量、 淫羊藿提取物組顯著升高， 但2 組之間無明顯差異； 但淫羊藿提取物組血清睪酮水平低于補腎益元低、 高劑量組， 可能與激素的脈沖式釋放有關。 張福生等[15］報道， 中藥可通過提高GnRH 基因轉錄與表達水平來提高GnRH 單位水平，也能通過調節FSH 來刺激睪酮分泌， 并且有些中藥本身具有性激素作用， 也可直接作用于性腺， 從而促進睪酮分泌；本實驗發現， 給藥組均能通過調控HPG 軸來顯著提高運動低血睪酮大鼠睪酮水平， 其中補腎益元方高劑量組更明顯。蔡德培等[16］指出， 補腎中藥可通過提高機體下丘腦-垂體促性腺功能， 從而提高機體機能狀態； 本實驗發現， 補腎益元方對HPG 軸具有多環節、 多靶點促進作用， 對長期大負荷強度運動訓練引起的運動性低血睪酮具有良好的調節作用， 有利于提高機體適應能力。

綜上所述， 補腎益元方能明顯改善運動性低血睪酮大鼠FSH、 LH、 GnRH mRNA、 蛋白表達， 從而調控HPG 軸，可為中藥抗運動性低血睪酮提供理論依據。 由于補腎益元方高劑量組療效優于淫羊藿提取物組、 補腎益元方低劑量組， 故建議在長期高強度運動訓練前， 運動員可使用與補腎益元方高劑量組（0.70 g／kg） 等效的成人劑量， 即1 次4 粒， 每天3 次， 以提高機體運動能力。