不同產地火絨草HPLC 指紋圖譜的建立及化學模式識別

趙 玥， 齊 越， 單國順， 王光函， 王 冰?

（1. 遼寧中醫藥大學， 遼寧 大連 116600； 2. 遼寧省中醫藥研究院， 遼寧 沈陽 110034）

火絨草目前還未被《中國藥典》 收載， 長久以來沒有法定的標準來衡量， 該野生資源豐富， 不同生長地區的環境有很大的差距， 光照、 年積溫、降水量、 土壤質地等生態因子都可能造成其外部形態和內在質量發生變化[5-6］。 由于中藥成分復雜，個別成分的測定不能完全代表其質量的復雜體系，因此選用多指標質量控制模式來全面反映所含化學成分的種類和數量， 從而體現整體性和綜合作用。本研究采用HPLC 法對遼寧、 河北等26 個產地35批火絨草進行指紋圖譜研究， 通過與對照品比對、相似度評價、 主成分分析、 聚類分析等識別技術進行分析， 以期為其質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； 電子天平（萬分之一，上海上天精密儀器有限公司）； HH 系列恒溫水浴鍋（江蘇金壇儀器廠）。 數據分析采用軟件中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004、 SPSS Statistics 20.0 軟件。

1.2 試藥 咖啡酸 （Y17D6C7672）、 綠原酸（R055F6F1）、 阿魏酸（H25M6L1）、原兒茶酸（Z30M6L1）、原兒茶醛 （Y01013FB14） 對照品，含有量均＞98%， 均購于上海源葉生物科技有限公司。 乙腈、 磷酸為色譜純； 其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

26 個產地火絨草共35 批， 其中3 批購于安國藥房， 其余采自各地， 由遼寧中醫藥大學王冰教授鑒定為正品， 見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B）， 梯度洗脫（0 ～10 min， 10% ～12% B； 10 ～20 min， 12% ～14% B； 20 ～30 min， 14% ～16% B；30 ～40 min， 16% ～22% B； 40 ～50 min， 22% ～30% B； 50～80 min， 30% ～52% B）； 柱溫25 ℃；體積流量1 mL／min； 檢測波長290 nm。

2.2 供試品溶液配制 取各產地火絨草剪切成段，各精密稱定1 g 置錐形瓶中， 加入50%乙醇25 mL，稱定質量， 回流提取1 h， 放冷， 50%乙醇補足減失的質量， 過濾， 取續濾液， 0.45 μm 微孔濾膜過濾， 取續濾液， 即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、 咖啡酸、阿魏酸、 原兒茶醛、 原兒茶酸適量， 加甲醇溶解制成 質 量 濃 度 分 別 為1.30、 1.66、 1.18、 1.04、1.34 mg／mL 的貯備液， 分別吸取0.5 mL 定容至10 mL 量瓶中， 即得。

2.4 方法學考察

101A-1型數顯電熱恒溫鼓風干燥箱，上海浦東榮豐科學儀器有限公司產品；JA503型電子天平，常州市幸運電子設備有限公司產品；JY92-Ⅱ型超聲波細胞破碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品；DZ-260T型DZQ系列真空包裝機。

2.4.1 精密度試驗 取同一火絨草 （S1）， 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下連續進樣6 次， 選取綠原酸作為參照峰，測得特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 均小于3%， 表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一火絨草（S1） 5 份，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1”項色譜條件下進樣， 測得各特征峰的相對保留時間、 相對峰面積RSD 均小于3%， 表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品（S1） 溶液，在“2.1” 項色譜條件下于0、 2、 6、 8、 12、 24 h進樣， 測得各特征峰的相對保留時間、 相對峰面積RSD 均小于3%， 表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5 指紋圖譜建立 35 批不同產地、 采收期火絨草按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1”項色譜條件下進樣， 并將所測的數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度計算軟件（2012 版）， S1 號樣品色譜圖中色譜峰峰形、 分離度良好， 基線平整， 故選擇其作為參照譜圖， 經多點校正后自動匹配生成的對照指紋圖譜， 見圖1～3， 共獲得19 個共有峰，通過比較樣品和對照品色譜分析保留時間及紫外吸收譜圖區， 確定綠原酸、 原兒茶醛2 種共有成分；5 個對照品沒有完全被指認為共有峰， 可能是不同產地藥材中成分差異造成的。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

圖1 樣品HPLC 指紋圖譜共有模式Fig.1 Common pattern of HPLC fingerprints of samples

2.6 指紋圖譜分析

2.6.1 相似度評價 不同產地火絨草相似度見表2。 結果表明， 35 批樣品與對照圖譜的相似度較高， S19 鞍山、 S26 青?，斍呖h、 S28 河北空中草

圖2 對照品HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of reference substances

圖3 35 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of thirty-five batches of samples

表2 35 批樣品相似度Tab.2 Similarities of thirty-five batches of samples

原景區的相似度相對較低， 分別為0.898、 0.893、0.819， 其余均大于0.9； S1 ～S11 均為鐵嶺市采集， 相似度RSD 在2.27%以下， 表明采于當地者質量均一性較好； S12 ～S15 為5 月至8 月沈陽產地， 相似度RSD 在1.21%以下， S22～S25 為5 月至8 月葫蘆島產地， 相似度RSD 在2.45% 以下，表明不同產地、 采收期樣品雖基本類似， 但在質量上存在一定差異， 沈陽產地質量均一性好于葫蘆島產地。

2.6.2 化學成分分析 不同產地樣品共19 個共有峰， 不同樣品同一共有峰的峰面積RSD 較大， 均大于50%， 表明所含成分種類相似， 但含有量差異明顯。 以不同產地樣品已指認有效成分（峰2為原兒茶醛， 峰3 為綠原酸） 峰面積之和作圖，比較其含有量變化， 結果見圖4， 可知S23 葫蘆島產地最低， S31 河南三門峽產地最高； 不同采收期樣品中， 沈陽祝家產地7 月、 葫蘆島產地5 月最高， 表明不同產地、 采收期樣品化學成分變化顯著， 藥材質量有很大差異。

圖4 不同產地樣品2 種有效成分峰面積總和Fig.4 Peak area sums of two kinds of effective components in samples from different growing areas

2.6.3 聚類分析 利用SPSS 20.0 軟件進行系統聚類分析， 將19 個共有峰峰面積標準化后進行聚類分析， 結果見圖5， 可知除去沈陽祝家鎮及葫蘆島產地的5 月至7 月樣品， 剩余29 批整體可分為2大類， S4、 S26、 S27、 S31、 S32 被歸為一類， 其他產地被歸為一類， 即青海省、 河南省、 遼寧昌圖縣泉頭鎮歸為一類， 遼寧省其他產地、 河北省歸為一類。 由此表明， 產地相同或地理位置相近的樣品被聚在一起， 與相似度結果基本一致。

圖5 29 批樣品樹狀圖Fig.5 Dendrogram of twenty-nine batches of samples

2.6.4 主成分分析 為進一步探討不同產地樣品之間的差異， 在相似度和聚類分析的基礎上， 對指紋圖譜數據進行主成分分析， 以標準化后的共有峰峰面積為變量， 利用SPSS20.0 軟件進行處理。 結果見表3。

以特征值大于1 為提取標準， 得前4 個成分累計貢獻率為88.853%， 代表了火絨草19 個共有變量88.853%的信息量， 具有較好的代表性， 由載荷矩陣獲得的載荷圖見圖6。 由圖可知， 距離原點較遠的幾個點為主成分中權重值最大的成分， 表明其在區分指紋圖譜差異中起決定性作用。

表3 相關矩陣Tab.3 Correlation matrices

圖6 各成分載荷圖Fig.6 Loading diagram of various constituents

以各主成分相應貢獻率為權重系數， 對各產地樣品進行綜合評價， 得綜合得分及排序情況， 見表4。 由表可知， 鐵嶺昌圖泉頭鎮（S4） 產地綜合評分最高， 表明其成分含有量較其他批次高， 與聚類分析所得結果吻合， 即2 種手段可互為佐證。

3 討論

3.1 條件優化 本實驗對檢測波長、 流動相、 提取方式、 溶劑、 時間進行考察， 通過HPLC-DAD檢測器全波長掃描， 綜合考慮共有峰的高度、 數量、 對照品最大吸收波長， 最終確定檢測波長為290 nm。 考察甲醇、 乙醇2 種溶劑及提取時間30 min、 1 h、 2 h， 優化出最佳工藝為火絨草用50%乙醇回流提取1 h。 考察甲醇-水、 乙腈-水、乙腈-磷酸等流動相系統， 最終選擇乙腈-磷酸， 此條件下各色譜峰保留時間適中， 數量較多， 分離度較好， 基線穩定， 能體現更多火絨所含成分， 有利于指紋圖譜的建立與分析。

3.2 結果分析 已有文獻報道采用化學識別模式對中藥材進行指紋圖譜研究[7-13］， 能充分體現藥材整體特征。 聚類分析根據藥材化學成分， 能將其所屬類別準確劃分； 主成分分析可篩選出共有特征成分， 找出決定性因素， 并得到綜合得分和排名， 兩者相互結合相互補充， 更加有利于客觀地評價中藥材真偽及其質量優劣。

表4 各樣品綜合得分及排序Tab.4 Comprehensive scores and ranks of various samples

本實驗采用指紋圖譜相似度分析、 聚類分析、主成分分析對不同產地、 采收期火絨草共有峰進行對比研究， 結果表明大部分產地樣品相似度較高；不同產地、 相同采收期質量不均一， 有一定差異性； 不同產地藥材明顯分為2 類， 遼寧鐵嶺昌圖泉頭鎮、 青海省、 河南省歸為一類， 遼寧其他地區、河北省歸為一類。 各產地氣候、 地理位置等生態環境的不同直接影響到藥材次生代謝產物（化學成分） 積累， 從而造成不同產地樣品質量參差不齊，因此生態環境相似或地理位置相近的產地被歸為一類。 綜上所述， 本實驗建立火絨草HPLC 指紋圖譜， 可為該藥材品質評價和質量控制提供參考依據。