UPLC-QE／MS 法分析丹參酒炙前后5 種質變化合物

崔偉亮， 李慧芬， 張學蘭， 宋夢晗， 刁家葳， 張丹捷， 王曉寧

（山東中醫藥大學， 山東 濟南 250355）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖[1］， 始載于《神農本草經》， 列為草部上品[2］， 生品性偏寒涼， 而酒制后寒涼之性緩和， 活血祛瘀、 調經止痛之功增強[3-5］。 中藥炮制是藥物中化學成分量變和質變的過程， 關乎藥性變化、 功能主治改變、 臨床應用調整[6］。現代研究發現， 丹參中主要含水溶性成分和脂溶性成分， 水溶性成分主要為多聚酚酸類， 有丹參素、 原兒茶醛、 丹酚酸A ～G、 紫草酸、 咖啡酸、迷迭香酸等， 具有抗缺血、 抗氧化、 改善微循環等作用[7-9］； 脂溶性成分大多為丹參酮類， 包括隱丹參酮、 丹參酮ⅡA、 丹參酮ⅡB、 二氫丹參酮Ⅰ、 二氫異丹參酮Ⅰ、 異丹參酮Ⅰ、 異丹參酮Ⅱ、 異隱丹參酮等， 具有改善血流循環、 抑制血小板聚集、 改善冠狀動脈供血、 提高耐缺氧能力等作用[10］。

課題組前期對丹參酒炙前后質變特征化合物進行了含有量測定， 發現酚酸類主要成分中丹參素鈉、 原兒茶醛、 迷迭香酸、 咖啡酸含有量升高， 丹酚酸B、 紫草酸含有量降低， 丹參酮類主要成分中丹參酮ⅡA、 丹參酮Ⅰ、 二氫丹參酮Ⅰ含有量升高，隱丹參酮含有量降低。 在前期工作的基礎上， 本實驗采用UPLC-QE／MS 法分析丹參酒炙前后5 種質變化合物模擬炮制品的化學成分， 探討丹參酒炙前后質變特征化合物的轉化機制， 為揭示其增效機理提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（美國Thermo 公司）； Q ExactiveTMhybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer （美國Thermo 公司）；FA1604N 型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）； NewClassic MF 型天平（十萬分之一， 瑞士Mettler-Toledo 公司）； LDZ4-0.8 型離心機（北京醫用離心機廠）； KQ-250E 型醫用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 迷迭香酸對照品（天津士蘭科技有限公司， 批號20283-92-5）， 原兒茶醛、 丹酚酸B、咖啡酸、 隱丹參酮、 丹參酮Ⅰ、 丹參酮ⅡA對照品（中國食品藥品檢定研究院， 批號分別為200102、111562-200403、 0810-9803、 0852-9601、 0867-200205、 110766-200416）； 丹參素、 阿魏酸、 紫草酸、 丹酚酸C、 二氫丹參酮Ⅰ（上海源葉生物科技有限公司， 批號分別為B20155、 B20007、 B21683、B20263、 B20256）。 甲醇為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 質變化合物模擬炮制品制備[11-12］稱取迷迭香酸、 丹酚酸B、 隱丹參酮、 二氫丹參酮Ⅰ、 丹參酮ⅡA對照品適量， 分別加80%甲醇超聲溶解， 即得。 取適量置于扁形稱量瓶中， 于200 ℃烘箱內烘20 min， 取出， 放涼， 備用。

2.2 供試品溶液制備 取“2.1” 項下烘干的各質變化合物模擬炮制品， 分別加1 mL 80%甲醇超聲溶解， 即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取丹參素、 原兒茶醛、 咖啡酸、 阿魏酸、 迷迭香酸、 紫草酸、 丹酚酸B、 丹酚酸C、 二氫丹參酮Ⅰ、 隱丹參酮、 丹參酮Ⅰ、 丹參酮ⅡA對照品各約0.5 mg， 分別置于1 mL量瓶中， 加80% 甲醇溶解并定容至刻度， 即得貯備液， 精密移取適量置于5 mL 量瓶中， 加80%甲醇稀釋并定容至刻度， 即得。

2.4 液質條件

2.4.1 正離子模式 Halo C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）； 流動相乙腈（A） -水（B）， 梯度洗脫（0～7 min， 70%→55%B； 7 ～12 min， 55%→40%B； 12～17 min， 40% →0B）； 柱溫45 ℃； 檢測波長280 nm； 進樣量3 μL； 體積流量0.25 mL／min。離子源為大氣壓離子源； 鞘氣體積流量310 kPa；輔助氣體積流量69 kPa； 裂解電壓3.5 kV； 源內溫度320 ℃； 輔助氣溫度350 ℃； S-lenS RF 水平55%； 分辨率70 000； 質譜掃描范圍m／z 100 ～1 000。

2.4.2 負離子模式 Halo C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）； 流動相乙腈（B） -水（A）， 梯度洗脫（0～5 min， 95%→60%A； 5 ～12 min， 60%→65%A； 12～15 min， 65%→0A）； 柱溫45 ℃； 檢測波長280 nm； 進樣量3 μL； 體積流量0.25 mL／min。離子源為大氣壓離子源； 鞘氣體積流量310 kPa；輔助氣體積流量69 kPa； 裂解電壓3.0 kV； 源內溫度320 ℃； 輔助氣溫度350 ℃； S-lenS RF 水平55%； 分辨率70 000； 質譜掃描范圍m／z 100 ～1 500。

2.5 丹參酒炙前后質變化合物模擬炮制品成分分析 化合物通過質譜數據解析、 已知對照品定位并參考文獻進行鑒別， UPLC-QE／MS 綜合分析， 發現了迷迭香酸、 丹酚酸B、 隱丹參酮、 二氫丹參酮Ⅰ、 丹參酮ⅡA。 混合對照品UPLC 色譜圖見圖1，5 種質變化合物模擬炮制品總離子流圖見圖2～6，數據分析見表1， 模擬炮制后分解產物見表2。

根據5 種化合物模擬炮制品的質譜數據， 由文獻及相應化合物在反相柱上的保留值可知， 在圖2～3 中， tR為1.12 min 得到m／z 197.04 [M-H］-的準分子離子峰， 其保留時間與丹參素對照品一致， 確定其相對分子質量為198.17， 與丹參素相符， 故鑒定為丹參素； tR為2.68 min 獲得分子離子峰m／z 179.03 [M-H］-， 其保留時間與咖啡酸對照品一致， 確定其相對分子質量為180.15， 與咖啡酸相符， 故鑒定為咖啡酸； tR為3.71 min 得到m／z 359.08 [M-H］-的準分子離子峰， 其保留時間與迷迭香酸對照品一致， 確定其相對分子質量為360.31， 與迷迭香酸相符， 故鑒定為迷迭香酸。

圖1 混合對照品UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of mixed reference substance

圖2 迷迭香酸總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of rosemary acid

圖3 丹酚酸B 總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatogram of salvianolic acid B

圖4 隱丹參酮總離子流圖Fig.4 Total ion current chromatogram of cryptotanshinone

圖5 二氫丹參酮Ⅰ總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of dihydrotanshinoneⅠ

圖6 丹參酮ⅡA 總離子流圖Fig.6 Total ion current chromatogram of tanshinoneⅡA

表1 丹參酒炙前后5 種質變化合物模擬炮制品UPLC-MS 鑒定結果Tab.1 UPLC-MS identification results of five kinds of qualitative change compounds in wine processing of S． miltiorrhiza

表2 丹參酒炙前后5 種質變化合物模擬炮制品成分分析結果Tab.2 Analysis results of five kinds of qualitative change compounds in wine processing of S． miltiorrhiza

圖3 中， tR為5.08 min 得到m／z 193.04 [MH］-的準分子離子峰， 其保留時間與阿魏酸對照品一致， 確定其相對分子質量為194.19， 與阿魏酸相符， 故鑒定為阿魏酸。 tR為1.28 min 得到m／z 193.04 [M-H］-的準分子離子峰， 其保留時間與原兒茶醛對照品一致， 確定其相對分子質量為194.19， 與原兒茶醛相符， 故鑒定為原兒茶醛； tR為3.87 min 得到m／z 537.10 [M-H］-的準分子離子峰， 其保留時間與紫草酸對照品一致， 確定其相對分子質量為538.46， 與紫草酸相符， 故鑒定為紫草酸。

圖4 中， tR為10.48 min 得到m／z 297.11[M＋H］＋的準分子離子峰， 其保留時間與隱丹參酮對照品一致， 確定其相對分子質量為296.35， 與隱丹參酮相符， 故鑒定為隱丹參酮。 圖5～6 中， tR為9.82 min 得到m／z 279.10 [M＋H］＋的準分子離子峰， 其保留時間與二氫丹參酮Ⅰ對照品一致， 確定其相對分子質量為278.30， 與二氫丹參酮Ⅰ相符， 故鑒定為二氫丹參酮Ⅰ； tR為12.46 min 得到m／z 277.08 [M＋H］＋的準分子離子峰， 其保留時間與丹參酮Ⅰ對照品一致， 確定其相對分子質量為276.29， 與丹參酮Ⅰ相符， 故鑒定為丹參酮Ⅰ； tR為12.46 min 得到m／z 295.13 [M＋H］＋的準分子離子峰， 其保留時間與丹參酮ⅡA對照品一致， 確定其相對分子質量為294.34， 與丹參酮ⅡA相符， 故鑒定為丹參酮ⅡA。

3 討論與結論

根據對照品定位并參照文獻， 采用UPLC-QE／MS 對丹參中5 種質變化合物模擬炮制品進行分析和成分鑒別， 結果表明該方法快速、 靈敏、 準確度高， 可較全面、 準確地分析各化合物在炮制過程中的變化規律， 為揭示丹參成分轉化機制提供科學依據。 實驗中曾采用100 ℃水浴加熱20、 50 min 模擬炮制， 但加熱前后各成分無明顯變化， 又采用烘箱200 ℃干烘10、 20、 50 min 對對照品進行模擬炮制， 模擬炮制前后成分變化也不大， 最后采用80%甲醇超聲溶解后于200 ℃烘20 min， 各成分發生較明顯變化。 本研究表明， 丹參酒炙前后質變的5 種主要成分在模擬炮制條件下均發生了質變。

國內外研究發現， 丹酚酸B 在體內首先代謝為丹參素及咖啡酸， 咖啡酸進一步代謝為阿魏酸和異阿魏酸， 兩者繼續代謝為甲基化阿魏酸[13-15］。同時， 有學者研究表明丹酚酸B 口服生物利用度低， 丹參素的生物利用度、 最大血藥濃度明顯高于丹酚酸B， 平均駐留時間、 半衰期明顯長于后者，故丹參素在體內作用持久[16］； 迷迭香酸在體內可代謝為咖啡酸、 阿魏酸、 甲基化迷迭香酸和香豆酸[17］； 隱丹參酮在體內可轉化為丹參酮ⅡA[18-19］。由此可知， 丹參酒炙后主要成分的體外模擬炮制產物與其體內代謝轉化基本一致， 推測丹參酒炙后活血化瘀藥效增強可能與丹酚酸B、 迷迭香酸、 隱丹參酮等分子量較大的主要成分炮制后轉化成更利于吸收、 活性更強的成分關系密切。