七十味珍珠丸對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障的保護作用

梁 源， 孫位軍， 王 張， 賈曉靜， 胥培艷， 付 珂， 徐文龍

（1. 成都中醫藥大學藥學院， 四川 成都 611137； 2. 成都中醫藥大學民族醫藥學院， 四川 成都 611137）

腦缺血屬于中樞神經系統急癥之一， 近年來發病率有明顯升高的趨勢， 具有恢復慢、 致殘率和致死率高的特點[1-3］， 發生缺血性中風的主要原因是血栓形成后堵塞血管， 引起腦血流量降低， 進而使腦組織發生缺血缺氧、 軟化甚至壞死[4］， 而缺血再灌注是導致病情加重的主要原因[3］。 腦缺血再灌注損傷后， 血腦屏障出現結構及功能改變[5］，前者主要表現在對微血管內皮細胞、 星形膠質細胞足突、 基底膜的影響， 對缺血更敏感的膠質細胞足突較微血管率先發生腫脹和退行性變， 膠質細胞皺縮， 毛細血管內可見出多個向管腔內伸入的呈偽足樣突起； 后者主要表現在通透性變化， 毛細血管內皮細胞間隙增大導致通透性增加。 在動物實驗中，可用伊文思藍來反映血腦屏障功能改變， 其損傷機制涉及ROS／RNS 損傷[6］、 MMPs 激活[7］、 炎細胞浸潤[8］、 水通道開放[9］、 鈣超載[10］等。

七十味珍珠丸（藏文譯音然納桑培） 始載于藏醫經典著作《四部醫典》 中， 由珍珠、 檀香、降香、 九眼石、 西紅花、 牛黃、 麝香等藥材組成，具有安神鎮靜、 通經活絡、 調和氣血、 醒腦開竅的作用[11］， 主要用于治療“黑白脈病” “龍血不調”， 以及中風、 癱瘓、 半身不遂等疾病[12］， 其中白脈病相當于現代醫學的神經系統疾病。 經查閱文獻發現， 尚無七十味珍珠丸對腦缺血再灌注損傷動物模型血腦屏障保護作用的報道， 故本實驗將對此進行考察， 并初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 試藥 七十味珍珠丸（西藏甘露藏藥股份有限公司， 批號16044A）； 尼莫地平片（拜耳醫藥保健有限公司， 批號BJ30601）。 SOD 試劑盒（貨號A001-1）、 MDA 試劑盒（貨號A003-1） （南京建成生物工程研究所）； 紅四氮唑（上海靈錦精細化工有限公司， 批號20160500）； 甲酰胺（成都市科隆化工試劑廠， 批號2017092901）； 多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司， 批號20160512）；甲苯胺藍（上海如吉生物科技發展有限公司， 批號120418）； PBS 緩沖液（北京中杉金橋生物技術有限公司， 批號ZLI-9062）； 蘇木素（北京百靈威科技有限公司， 批號LM10N13）； 伊紅（東京化成工業株式會社， 批號GL01-GMPC）； 依文思藍（上海如吉生物科技發展有限公司）。 沒食子酸（批號PS000688）、 柯里拉京（批號PS000532）、鞣花酸（批號PS14102401） 對照品（成都普思生物科技股份有限公司， 含有量大于98%）。 乙腈為色譜純（安徽天地高純溶劑有限公司）； 甲醇為分析純（西格瑪奧德里奇貿易有限公司）。

1.2 儀器 電子天平[賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； 紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）； 臺式高速冷凍離心機（上海天美生化儀器設備工程有限公司）； 全自動生化分析儀（上海特康科技有限公司）； TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機、 BMJ-Ⅲ型包埋機、 PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；數碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）； LC-2010A HT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.3 動物 SPF 級SD 雄性大鼠72 只， 體質量（260±10） g， 購自成都達碩實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK （川） 2015-030， 四川省實驗動物質量合格證號 51203500003428、51203500003567 等。

2 方法

2.1 分組與劑量 大鼠隨機分為假手術組、 模型對照組、 尼莫地平片組（30.00 mg／kg）、 七十味珍珠丸組（66.68 mg／kg）， 每組再分為3 個亞組（腦梗死率、 血腦屏障通透性、 腦組織形態學），其中七十味珍珠丸臨床用藥劑量為重病患者每天1 g （1 丸）， 一般患者每隔3 ～7 d 1 g （1 丸）。 前期課題組[12-13］開展七十味珍珠丸抗大鼠腦缺血再灌注損傷的量效關系（0.52、 1.04、 2.08、 4.17、8.33、 16.67、 33.34、 66.68、 133.36 mg／kg， 分別 為 成 人 用 量 的0.031 25、 0.062 5、 0.125、0.25、 0.5、 1、 2、 4、 8 倍） 及其對線栓致大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的時效關系（2、 6、 12、24、 48、 72 h， 劑量為33.50 g／kg， 即臨床成人用量的2 倍） 研究， 發現66.68 g／kg （臨床成人用量的4 倍） 為最佳劑量， 故本實驗設置該劑量進行研究。

2.2 造模與給藥 參考文獻[14］， 沿大鼠頸部正中線偏右作一切口， 止血鉗鈍性分離淋巴組織及腺體， 在胸骨舌骨肌、 胸鎖乳突肌、 二腹肌后腹交界空隙處分離右側頸總動脈， 在近心端處系1 根縫合線， 止血鉗夾住線頭以起到牽拉作用； 沿頸總動脈向大腦方向繼續分離頸外動脈和頸內動脈， 在兩者分叉處結扎頸外動脈， 止血鉗夾住頸外動脈的結扎線以起到牽拉作用， 再沿頸內動脈往內分離翼腭動脈， 在分叉處結扎。 然后， 在頸外動脈遠心端的結扎線和近心端的松結之間剪一小口， 在自制挑針輔助下將栓線插入到頸內動脈， 長度約20 mm （從頸總動脈分叉處算起）， 縫合手術創口并消毒， 術中保溫至大鼠清醒， 大腦中動脈阻斷2 h 后進行再灌注， 而假手術組僅在動脈處備線處理， 不造模。考慮到七十味珍珠丸在臨床上每隔3 ～7 d 給藥1次， 具有“緩釋樣效應”， 并結合課題組前期研究結果[12-13］， 本實驗也僅給藥1 次， 手術前灌胃給予七十味珍珠丸混懸液、 尼莫地平混懸液或生理鹽水， 給藥體積均為10 mL／kg。

2.3 腦梗死率檢測 大鼠腦缺血24 h 時麻醉取血后， 立即取出全腦， 濾紙吸干腦組織表面水分稱定質量后， 將其置于-20 ℃冰箱中速凍20 ～30 min，用配好的1% TTC 緩沖液染色30 min， 分離梗死組織呈蒼白色部分， 濾紙吸干腦組織表面水分稱定質量， 計算腦梗死率（腦梗死部分質量／腦組織質量×100%）。

2.4 神經行為學評分 參考Longa[15］、 Bederson[16］的5 分制法， 在大鼠腦缺血后2、 24 h 時應用表1進行評分， 分值越高， 表明大鼠行為障礙越嚴重。

表1 神經行為學評分Tab.1 Neurobehavioral scores

2.5 腦組織病理學評價和尼氏小體計數 取各組大鼠的缺血側腦組織， 4%多聚甲醛溶液固定、 脫水、 石蠟包埋， 部分進行蘇木精-伊紅（HE） 染色， 光鏡下觀察腦組織病變程度， 分為“-” （未見病變）、 “＋” [小灶性灰、 白質水腫， 細胞溶解；小灶性灰、 白質細胞萎縮， 胞漿及核深染； 灶性少許細胞增生（主要為膠質細胞）； 輕度血管周水腫； 輕度血管充血、 出血； 少許炎細胞浸潤； 輕度灰質萎縮薄； 少許室管膜細胞增生］、 “＋＋” [多灶性灰、 白質水腫， 細胞溶解； 灶性灰、 白質細胞胞萎縮， 胞漿及核深染； 灶性較多細胞增生（主要為膠質細胞）； 中度血管充血、 出血； 較多炎細胞浸潤。 中度血管周水腫］、 “＋＋＋” [彌漫性灰、白質水腫， 細胞溶解； 多灶性灰、 白質細胞萎縮，胞漿及核深染； 灶性大量細胞增生（主要為膠質細胞）； 重度血管充血、 出血； 大量炎細胞浸潤］；部分腦組織用甲苯胺藍水溶液染色， 光鏡下觀察尼氏小體數。

2.6 血清SOD、 MDA 水平檢測 大鼠24 h 腹腔注射水合氯醛麻醉， 腹主動脈采血5 mL， 離心（3 500 r／min） 10 min 分離血清， 取上清液， 按試劑盒方法測定。

2.7 血腦屏障通透性評價 大鼠腦缺血24 h 時麻醉， 股靜脈緩慢注射2% 伊文思藍 （EB） 溶液（4 mL／kg）， 2 h 后心臟灌注， 迅速斷頭取腦， 去除皮質表面蛛網膜、 腦室脈絡叢， 取缺血側大腦稱定質量， 充分剪碎后置于5 mL 甲酰胺溶液中，60 ℃水浴下靜置24 h， 離心（20 ℃、 12 000 r／min）15 min， 取上清液， 620 nm 波長處測定光密度； 甲酰胺溶液作為空白對照， 配制8、 4、 2、 1、 0.5、0.25、 0.125 μg／mL EB 溶液， 測定光密度， 繪制標準曲線（Y 為光密度， X 為溶液質量濃度） 為Y=17.436X＋0.012 8 （R2=0.999 7）， 計算腦組織EB 含有量（樣品中EB 含有量×甲酰胺溶液體積／腦組織質量）[17-28］。

2.8 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（） 表示， 組間比較采用方差分析； 等級資料組間比較采用非參數檢驗。 P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 成分分析 采用課題組前期建立的方法[29］，通過HPLC 法進行分析， 條件為柱溫30 ℃； 體積流量0.8 mL／min； 檢測波長254 nm； 流動相乙腈-0.2%磷酸， 梯度洗脫， 色譜圖見圖1。

3.2 腦梗死率 表2、 圖2 顯示， 與假手術組比較， 模型對照組腦梗死率顯著增加（P＜0.01）； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組其梗死率顯著降低（P＜0.01）。

3.3 神經行為學評分 表3 顯示， 與假手術組比較， 模型對照組在2、 24 h 有顯著的神經行為學異常（P＜0.01）， 表現為大鼠向左轉圈、 向左側傾倒、 左前腳不自然伸直等； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組在24 h 其異常顯著改善（P＜0.01）。

圖1 七十味珍珠丸HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of Qishiwei Zhenzhu Pills

表2 七十味珍珠丸對腦梗死率的影響 n=6）Tab.2 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on cerebral infarction rate n=6）

表2 七十味珍珠丸對腦梗死率的影響 n=6）Tab.2 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on cerebral infarction rate n=6）

注：與假手術組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，??P＜0.01

假手術組 — 0.00±0.00模型對照組 — 15.06±1.87##尼莫地平片組 30.00 6.65±3.15??七十味珍珠丸組 66.68 2.77±2.45??

圖2 各組大鼠腦組織Fig.2 Brain tissues of rats in various groups

3.4 尼氏小體數 表4、 圖3 顯示， 與假手術組比較， 模型對照組尼氏小體數顯著減少 （P ＜0.01）； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組其數量顯著增加（P＜0.05）。

表3 七十味珍珠丸對神經行為學評分的影響s， n=6）Tab.3 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on neurobehavioral scores ， n=6）

表3 七十味珍珠丸對神經行為學評分的影響s， n=6）Tab.3 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on neurobehavioral scores ， n=6）

注：與假手術組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，??P＜0.01

假手術組 — 6 0 0 0 0 — 6 0 0 0 0 —模型對照組 — 0 1 5 0 0 0.001## 0 5 0 1 0 0.001##尼莫地平片組 30.00 0 2 3 1 0 0.923 0 3 3 0 0 0.002??七十味珍珠丸組 66.68 0 0 6 0 0 0.317 0 4 2 0 0 0.002??

表4 七十味珍珠丸對尼氏小體數的影響 n=6）Tab.4 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on Nissl body count n=6）

表4 七十味珍珠丸對尼氏小體數的影響 n=6）Tab.4 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on Nissl body count n=6）

注：與假手術組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，?P＜0.05

假手術組 — 76.78±5.62模型對照組 — 60.39±5.07##尼莫地平片組 30.00 62.67±8.16七十味珍珠丸組 66.68 71.39±9.14?

3.5 腦組織病理變化 表5、 圖4 顯示， 與假手術組比較， 模型對照組大鼠缺血側腦組織灰質和海馬神經細胞水腫、 空泡變性明顯， 細胞結構模糊，呈腦缺血、 缺氧性改變（P＜0.01）； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組細胞變性、 水腫程度均有一定程度減輕， 但無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 七十味珍珠丸對病理切片等級的影響（x ±s， n=6）Tab.5 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on pathological section grade ±s， n=6）

表5 七十味珍珠丸對病理切片等級的影響（x ±s， n=6）Tab.5 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on pathological section grade ±s， n=6）

注：與假手術組比較，##P＜0.01

假手術組 — 4 2 0 0 —模型對照組 — 0 1 5 0 0.004##尼莫地平片組 30.00 1 1 4 0 0.461七十味珍珠丸組 66.68 1 2 3 0 0.211

3.6 SOD 活性、 MDA 水平 表6 顯示， 與假手術組比較， 模型對照組SOD 活性、 MDA 水平無明顯變化（P＞0.05）； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組兩者有降低趨勢， 但無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠腦組織顯微圖（尼氏染色， ×400）Fig.3 Micrographs for brain tissues of rats in various groups （Nissl staining， ×400）

圖4 各組大鼠組織病理形態（HE 染色， ×400）Fig.4 Histopathologic morphologies of rats in various groups （HE staining， ×400）

表6 七十味珍珠丸對SOD 活性、 MDA 水平的影響 n=6）Tab.6 Effects of Qishiwei Zhenzhu Pills on SOD activity and MDA level （s， n=6）

表6 七十味珍珠丸對SOD 活性、 MDA 水平的影響 n=6）Tab.6 Effects of Qishiwei Zhenzhu Pills on SOD activity and MDA level （s， n=6）

注：與模型對照組比較，?P＜0.05

組別 劑量／（mg·kg-1） SOD／（U·mL-1） MDA／（mmol·mL-1）假手術組 — 325.163 3±28.740 2 3.881 0±1.496 9模型對照組 — 332.338 8±25.298 8 3.976 3±1.236 9尼莫地平片組 30.00 390.565 0±52.725 1? 2.047 5±0.932 9?七十味珍珠丸組 66.68 328.238 5±33.880 2 3.333 3±1.244 4

3.7 血腦屏障通透性 表7、 圖5 顯示， 與假手術組比較， 模型對照組EB 含有量顯著升高（P＜0.01）； 與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組其含有量顯著降低（P＜0.05）。

4 討論

尼氏染色是觀察缺血腦組織內神經元尼氏體的經典方法[30］， 染色結果表明， 模型對照組大鼠缺血側腦組織尼氏小體受損嚴重、 溶解或消失明顯，而七十味珍珠丸組大鼠缺血側腦組織尼氏小體數量增加。 HE 染色結果表明， 模型對照組大鼠缺血側大腦灰質水腫， 染色較淡， 透光度增強， 各細胞層排列紊亂， 細胞空泡變性， 胞漿疏松、 腫脹， 細胞呈不規則形， 細胞核濃縮深染， 部分可見小膠質細胞增生， 其中2 例（2／6） 海馬結構較完整， 海馬椎體細胞固縮、 深染、 核仁模糊， 少量椎體細胞壞死； 七十味珍珠丸組大鼠缺血側大腦灰質水腫或空泡變性， 染色透光度增強， 細胞胞漿疏松、 腫脹變性， 胞核濃縮深染， 偶見有小膠質細胞增生， 其中2 例（2／6） 海馬組織水腫變性、 染色淺， 椎體細胞排列紊亂、 極向不清， 椎體細胞胞質腫脹、 疏松， 胞膜邊界模糊不清， 有改善趨勢。 TTC 染色結果表明， 模型對照組大鼠腦梗死率增加， 而七十味珍珠丸組其明顯降低。 神經行為學結果表明， 模型對照組大鼠在2、 24 h 神經行為學明顯異常， 而七十味珍珠丸大鼠上述異常明顯改善。 綜上所述， 七十味珍珠丸對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織有明顯保護作用。

表7 七十味珍珠丸對EB 含有量的影響±s， n=6）Tab.7 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on EB contents， n=6）

表7 七十味珍珠丸對EB 含有量的影響±s， n=6）Tab.7 Effect of Qishiwei Zhenzhu Pills on EB contents， n=6）

注：與假手術組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

假手術組 — 3.867 8±2.734 0模型對照組 — 11.794 3±2.423 0##尼莫地平片組 30.00 7.622 6±1.883 5??七十味珍珠丸組 66.68 7.953 8±1.911 0?

圖5 各組大鼠血腦屏障通透性Fig.5 Blood-brain barrier permeabilities of rats in various groups

血腦屏障是維持腦內微環境的穩定、 保證大腦正常功能的特殊屏障， 在向腦內進行營養物質運輸、 阻擋有害物質進入大腦中發揮著重要作用， 主要由血管內皮細胞、 星形膠質細胞、 細胞外基質共同組成1 個緊密結構[4，21-32］， 其損傷將直接導致神經元所處生理環境改變， 并伴隨神經炎癥發生、 氧化應激、 腦水腫等現象[33-34］， 最終會引起突觸和神經元功能紊亂[35］， 而且腦缺血再灌注損傷將導致其結構受損， 通透性增加[5］。 本實驗采用伊文思藍透過法檢測血腦屏障通透性， 發現模型對照組大鼠腦組織EB 含有量明顯升高， 表明可造成血腦屏障損傷， 通透性增加； 七十味珍珠丸組其含有量明顯降低， 通透性減少， 表明它對血腦屏障有保護作用。

活性自由基能氧化細胞膜和基底膜上的不飽和脂肪酸， 引起血管內皮細胞和基底膜損傷， 從而破壞血腦屏障完整性[12］， 而MDA 是主要脂質過氧化物， 能使細胞的結構和功能發生破壞[36］。 本實驗發現與模型對照組比較， 七十味珍珠丸組大鼠血清SOD 活性、 MDA 水平有降低趨勢， 表明其保護血腦屏障的作用機制可能與氧化應激有關。

七十味珍珠丸組方多， 而且為保密處方， 對血腦屏障發揮保護作用的機制較復雜。 本實驗從血腦屏障通透性角度進行考察， 可為今后研究七十味珍珠丸ROS／RNS-MMPs-TJs 信號通路提供參考。