HPLC 法同時(shí)測(cè)定溫腎養(yǎng)肝顆粒中4 種成分

胡 瑋， 顧麗亞， 周亞萍， 毛春芹， 陸兔林， 談瑄忠?

（1. 南京市中醫(yī)院， 江蘇 南京 210001； 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 南京 210023）

溫腎養(yǎng)肝顆粒由肉蓯蓉、 烏藥、 白芍、 山藥、鉤藤、 益智仁6 味藥材組成， 具有溫腎助陽(yáng)、 柔肝益氣之功效， 為南京市中醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方， 主要用于治療腎陽(yáng)虛衰、 肝血不足、 脾虛氣弱型帕金森氏病非運(yùn)動(dòng)癥狀[1-2］。 方中肉蓯蓉為君藥， 補(bǔ)腎益精， 主要成分為苯乙醇苷類， 以松果菊苷和毛蕊花糖苷為代表[3-6］， 具有抗氧化、 調(diào)節(jié)免疫、 延緩衰老的作用[6］； 烏藥抗炎鎮(zhèn)痛， 去甲異波爾定是其主要藥效成分[7］； 白芍具有明顯的免疫調(diào)節(jié)、 鎮(zhèn)靜活性， 其主要成分為芍藥苷， 對(duì)驚厥有拮抗作用[8］。 本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定溫腎養(yǎng)肝顆粒中上述4 種成分的含有量， 以期為該制劑臨床用藥安全、 質(zhì)量可控提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 型高效液相色譜儀， 配置Waters 2998 檢測(cè)器、 Empower 色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）； Milli-Q Intergral 純化系統(tǒng) （美國(guó)Millipore 公司）； MS105DU 型電子分析天平（十萬(wàn)分之一， 瑞士Mettler-Toledo 公司）； FA1104 型電子分析天平（萬(wàn)分之一， 上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 去甲異波爾定 （批號(hào) 111825-201402）、 松果菊苷（批號(hào)111670-201706）、 芍藥苷（批號(hào)110736-201741）、 毛蕊花糖苷 （批號(hào)111530-201512） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。 溫腎養(yǎng)肝顆粒 （批號(hào)180825、 180826、180827， 8 g／袋） 由南京市中醫(yī)院提供。 磷酸為分析純； 乙腈為色譜純； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[9-10］AkzoNobel Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.2%磷酸（B）， 梯度洗脫（0 ～30 min， 15% ～85%A； 30 ～33 min， 35% ～65% A； 33 ～40 min，15% ～85%A）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm （去甲異波爾定、 芍藥苷）、330 nm （松果菊苷、 毛蕊花糖苷）； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 分別含去甲異波爾定、 松果菊苷、 芍藥苷、 毛蕊花糖苷0.413、 1.069、 2.036、0.294 mg 的貯備液， 精密量取適量， 置于5 mL 量瓶中， 甲醇定容， 搖勻， 制成每1 mL 分別含四者0.082 6、 0.213 8、 0.407 1、 0.058 7 mg， 即得。

2.3 供試品溶液制備 取1 袋顆粒， 研細(xì)， 精密稱取2 g 粉末， 置于具塞錐形瓶中， 精密加入25 mL 50%甲醇， 密塞， 稱定質(zhì)量， 超聲（100 W、40 kHz） 30 min， 放冷， 50% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 濾過(guò)， 取續(xù)濾液， 即得[4］。

2.4 陰性樣品溶液 按處方和工藝， 分別制備缺肉蓯蓉、 烏藥、 白芍陰性樣品， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備， 即得。

2.5 專屬性試驗(yàn) 吸取對(duì)照品、 供試品、 陰性樣品溶液適量， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。 由圖可知， 各成分分離度良好 （＞1.5）， 陰性無(wú)干擾， 表明方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 mL， 置于1 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸， 結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得去甲異波爾定、 松果菊苷、 芍藥苷、 毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為1.7%、 2.5%、 2.3%、 2.8%， 表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液 （批號(hào)180826）， 于0、 3、 6、 9、 12、 24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得去甲異波爾定、 松果菊苷、 芍藥苷、 毛蕊花糖苷峰面積RSD 分別為1.1%、 2.3%、 1.9%、 1.3%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒（批號(hào)180826）6 份， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得去甲異波爾定、 松果菊苷、 芍藥苷、 毛蕊花糖苷含有量RSD分別為2.4%、 1.3%、 2.1%、 1.6%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取各對(duì)照品適量，制成每1 mL 分別含去甲異波爾定、 松果菊苷、 芍藥 苷、 毛 蕊 花 糖 苷 0.493、 1.281、 2.443、0.369 mg的對(duì)照品溶液。 再將顆粒（批號(hào)180826）研細(xì)， 精密稱取9 份粉末， 每份1 g， 均分為3 組，置于具塞錐形瓶中， 分別加入對(duì)照品溶液0.8、1.0、 1.2 mL， 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定， 計(jì)算回收率， 結(jié)果見(jiàn)表2。

2.11 樣品含有量測(cè)定 取3 批顆粒， 每批精密稱取2 g， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg／g， n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描（200～400 nm）， 發(fā)現(xiàn)在330 nm 波長(zhǎng)處松果菊苷、 毛蕊花糖苷有最大吸收， 而在238 nm 波長(zhǎng)處芍藥苷、 去甲異波爾定響應(yīng)值較高， 峰形理想。

3.2 流動(dòng)相選擇 參照文獻(xiàn)[9-15］， 本實(shí)驗(yàn)比較了 甲 醇-水、 乙 腈-三 乙 胺、 甲 醇-磷 酸、 乙 腈-0.1% ／0.2%磷酸、 甲醇／乙腈-甲酸等流動(dòng)相， 發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2% 磷酸分離效果較好， 可達(dá)到分離度要求。

3.3 樣品處理方法選擇 參考文獻(xiàn)[9-15］， 本實(shí)驗(yàn)比較了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇（50%、 70%、 80%）和乙醇（50%）， 發(fā)現(xiàn)50% 甲醇提取時(shí)峰形較好，雜質(zhì)較少。 然后， 比較了不同提取方式（超聲、回流） 和提取時(shí)間（20、 30、 40 min）， 發(fā)現(xiàn)超聲30 min 時(shí)即可提取完全。