臨床梅毒螺旋體菌株兔感染模型構建

張 園 任 卓 侯建玲 鄭榮濤 李中偉劉建新 龐 靜 黃 娜 田洪青1,

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)感染所致的一種性傳播疾病，危害極大，可侵犯全身各組織器官或通過胎盤傳播引起死產、流產、早產和胎傳梅毒。據國家衛生和計劃生育委員會發布數據，近十年來梅毒居乙類傳染病發病數前3位，梅毒受到廣泛關注。梅毒螺旋體長期以來無法成功連續體外培養，很大程度上限制了對梅毒的研究。雖然目前有關于梅毒螺旋體長期體外培養的文章報道[1]，但是過程復雜。另一方面，通過對梅毒螺旋體全基因組測序發現不同地域不同菌株之間存在一定差異，此差異是否影響發病機制尚未清楚[2]。同時，梅毒研究多基于臨床Nichols標準株[3,4]，由于地域差別，對標準株的研究遠遠不能滿足對當地梅毒的認知。因此，建立并研究當地梅毒螺旋體臨床菌株感染動物模型具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭雄兔購于濟南西嶺角養殖繁育中心，體重2.5～3.5 kg，年齡4個月左右，取血清行梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)、梅毒甲苯胺紅不加熱血清血清試驗(TRUST)檢測以排除兔梅毒螺旋體感染，預先飼養1周使其適應環境，并予不含有抗生素的飼料、水喂養。

1.1.2 菌株 采自山東省皮膚病醫院門診疑似或確診梅毒的患者。取其皮損分泌物，共收集6例菌株。詢問病史，患者自述發病前均有不潔性交史，發病前后無抗生素服用史。其中，患者A、D的TRUST滴度較高，而Tp-PCR陰性，可能原因為臨床標本Tp含量低，或Tp-PCR實驗過程中Tp-DNA提取不充分。患者F已在外院確診梅毒，拒絕行Tp-PCR檢測。基本臨床信息見表1。本研究通過倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

表1 患者基本臨床信息

注：“-”為陰性，“N”未行Tp-PCR檢測

1.1.3 試劑 戊巴比妥鈉(山東省實驗動物中心惠贈)，0.9%生理鹽水，正常兔血清(NRS)(自制)，梅毒螺旋體抗體檢測(TPPA)試劑盒(凝集法)(FUJIREBIO INC)，梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(TRUST)診斷試劑(上海榮盛生物藥業有限公司)，梅毒螺旋體(Tp)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒(廣州達安基因生物科技有限公司)。

1.1.4 儀器及相關器材 2mL及5mL注射器，漩渦混合器，兔固定箱，解剖臺，實時熒光定量PCR儀ABI7500/7300，生物安全柜，兩套無菌手術刀、手術剪、組織鑷、止血鉗，培養皿，酒精棉球，離心管，離心機，凍存管。

1.2 方法

1.2.1 臨床菌株分離 患者充分暴露皮損，無菌棉簽清潔梅毒患者皮損，拭子棉簽刮取皮損滲液。每位患者取三個拭子，一個用于Tp-PCR檢測，另兩個用于兔睪丸接種。

1.2.2 菌懸液制備 分別向兩個拭子管內加入800 μL 0.9%生理鹽水，室溫震蕩3 min，洗脫拭子棉簽中梅毒螺旋體，將含菌生理鹽水轉入1.5 mL無菌離心管中，加入200 μL NRS，制備為20%NRS菌懸液，4℃保存。

1.2.3 接種 將新西蘭兔置于兔盒中，按30 mg/kg 3%戊巴比妥鈉行耳緣靜脈注射麻醉，待充分麻醉，將其固定于實驗動物操作臺。按壓下腹部充分暴露兔睪丸，消毒睪丸及其周圍皮膚，先后取兩只注射器各吸取1～1.2 mL菌懸液分別注入兩側睪丸內。接種過程中固定睪丸以防回縮，注射器針頭應插入睪丸中間位置，防止菌懸液注入陰囊內。當接種凍存的菌株時，需解凍至室溫，以免凍傷兔睪丸。

1.2.4 傳代 待兔血清學檢測TPPA陽性，兔睪丸出現腫脹變硬時，90 mg/kg 3%戊巴比妥鈉靜脈注射處死感染梅毒模型兔，將兩側睪丸分離置于無菌培養皿中，快速轉移至無菌安全柜內。無菌手術刀及手術剪將睪丸切碎，移入無菌離心管內。向離心管中加入10 mL 50% NRS(NRS與0.9%生理鹽水混合)。震蕩10 min，300×g水平離心7 min。吸取菌懸液置于無菌離心管，再接種。實驗操作過程應嚴格遵循無菌操作，符合動物實驗倫理，實驗人員做好自我防護。

1.2.5 保存 取2 mL無菌凍存管，加入1 mL 50% NRS菌懸液，再加入1 mL 100%無菌甘油，將菌懸液與甘油輕輕吹打混勻，置于-80℃冷凍保存備用。

1.2.6 計數 吸取50 μL菌懸液，按照梅毒螺旋體(Tp)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒說明書操作，對菌懸液進行定性定量分析。

1.2.7 臨床觀察與血清學檢測 接種第3天后，每隔3天觀察、觸診睪丸變化。每隔7天抽血檢測TPPA、TRUST。

2 結果

2.1 原代兔梅毒模型 采集6株臨床梅毒螺旋體，接種成功5株，即A、C、D、E、F株。B株兔模型于接種后因缺氧第2天死亡，可能由于麻醉期間誤吸所致。A、 C、D、E、F菌株分別于接種后第28天、7天、14天、32天、35天TPPA轉陽，A菌株梅毒兔模型一側睪丸腫大(圖1)，C、D菌株梅毒兔模型雙側睪丸均發現腫大，D菌株兔模型一側陰囊出現潰瘍(圖2)。A、C、D菌株分別于接種后第49天、88天、105天處死感染兔，切除睪丸，制備菌懸液，取50 μL菌懸液行PCR熒光檢測，A、C、D分別計數為8.87×106、1.03×105、1.03×103，結果匯總見表2。

2.2 傳代兔梅毒模型 對A菌株傳代，兔于接種后平均6天出現睪丸腫脹，血清學TPPA轉陽平均時間為接種后7.7天，睪丸平均分離時間為接種后13.3天，取第一、二、三代50 μL菌懸液行PCR熒光檢測計數分別為2.63×106、1.22×104、5.38×104，見表3。三代感染兔均出現睪丸腫脹，未發現淋巴結腫大、眼損傷等臨床癥狀。

圖1 A菌株兔模型左側睪丸腫大

圖2 D菌株兔雙側睪丸腫大，左側陰囊見一潰瘍損害

菌接種時間TPPA轉陽時間(d)分離時間(d)Tp-PCRA201803012849天8.87×106C20180813788天1.03×105D2018082714105天1.03×103E2018120732--F2019012135--

注:未對E、F菌株分離

表3 A菌株原代與傳代梅毒兔模型睪丸炎

注：*為弱陽性

2.3 冷凍菌株兔梅毒模型 第二代菌株凍存55天后接種于兔睪丸，第12天出現睪丸腫脹，第14天TPPA陽性，第39天TRUST陽性，滴度為1∶4。

3 討論

梅毒螺旋體體外培養困難，建立合適的動物模型是研究梅毒的重要方法。研究發現，Tp可在猿猴、白鼠、倉鼠、豚鼠、家兔體內繁殖[5]。經過大量實驗表明，家兔是最理想的梅毒研究動物模型，現已用于明確接種后各階段梅毒兔的病理生理及相關影響因素的變化，對梅毒發病機制、診斷方法、藥物治療及預后等多方面重要意義[6]。

梅毒感染模型建立受眾多因素影響，主要包括菌株因素、宿主因素、實驗條件因素及實驗方法因素。首先為菌株因素，其包括菌株類型、來源及含菌量。大量研究已證實Nichols株適應兔睪丸內生長，而其他菌株較難適應兔睪丸內生長增殖[7]。不同類型菌株，其毒力不同。Nichol菌株毒力較大，1～2個Tp即可引起睪丸炎發生。如同樣接種100萬Tp，Nichols菌株和Gand菌株的持續時間分別為6～8天、39天[8]。另外，菌株來源廣泛，如梅毒患者血液、皮損分泌物、腦脊液、皮損組織等，Gayet-Ageron等[9]對Tp-PCR的敏感性及特異性進行分析，發現一期梅毒患者硬下疳分泌物和先天梅毒新生兒血液中敏感性最高。Tong等[10]對梅毒兔感染試驗(RIT)進行再評估，結果顯示一期患者皮損分泌物比神經梅毒腦脊液的RIT陽性率高，且腦脊液感染所需時間更長，同時作者對樣本分析發現服用抗生素治療后的臨床樣本RIT陽性率較低。最新研究表明，一期、二期梅毒患者全血中Tp-DNA較潛伏梅毒高，且檢出率與患者RPR滴度有相關性[11]。可見，一期、二期梅毒患者更容易取到Tp。冷凍菌株感染性較弱，但可能由于菌株保存過程中菌活力降低，所以發病期延長[12]。1925年，Chesney等[13]實驗顯示接種菌量主要影響潛伏期和持續時間，即菌量越多，潛伏期越短，而對疾病發展無明顯影響,接種最少致病菌量，同樣可使產生明顯的損害。

其次為宿主，即兔及實驗條件因素。1923年，Chesney等[14]探究了兔性別與年齡對梅毒兔模型的影響，發現年齡小于6個月且睪丸成熟的雄兔對Tp反應更加明顯，所以推薦選用睪丸成熟且年齡小的雄兔作為梅毒兔模型。接種前后，兔需無抗生素食物喂養，當體內含有抗生素時，菌株侵襲力降低。因Tp對較高溫度不耐受，當接種后皮膚溫度20℃以上時，皮損較輕，孵育期較長，說明低溫有利于Tp的增殖，大量實驗證明飼養溫度保持18℃～20℃有利于Tp生長及兔皮損形成。在夏季，盡管嚴格控制溫度，Tp生長和皮損形成缺乏穩定性，可能由于兔體內激素發生變化[7]。新西蘭兔實驗前應在實驗動物房內至少飼養一周，使其熟悉適應實驗條件，有助于減少不良反應甚至死亡發生。接種前有必要禁飲食，以防麻醉時發生胃內容物反流而誤吸引起吸入性肺炎致命。接種后，應密切觀察飲食、身體變化等，當實驗前后飲食量及身體變化較大時，應分析原因，做好準備措施，以預防兔死亡。同一菌株A接種于不同新西蘭兔，TPPA轉陽時間及臨床改變不盡相同，推測可能由于兔自身的免疫功能差異所決定。接種Tp同時注射激素，可增加皮損內Tp數量，有助于皮損形成[15]。

梅毒兔模型的構建，不僅受菌株因素、兔及實驗條件的影響，另外實驗方法同樣重要。Tp抵抗力極弱，對熱及干燥均特別敏感。血液中4℃放置72～120 h后死亡[16]，56℃加熱5 min死亡或離體后干燥1～2 h即死亡，對常用化學消毒劑敏感，10～29 g/L石碳酸內數分鐘死亡體外存活時間較短，所以需要在菌株分離、收集后的1 h內完成接種，這就要求實驗前應準備好試劑、器材，獲取Tp后快速接種，以免錯過最佳存活時機，從而影響菌株的增殖。制備菌懸液時，可加入10%～50%正常兔血清延長Tp體外存活時間。雖有文獻報道Tp可體外存活數小時，但隨著時間的延長會降低接種成活率，所以推薦盡快接種。Tp傳代方法很多，如皮內、靜脈、顱內注射，依據實驗目的選擇接種方式，但傳統以睪丸內注射為主。Chesney等[14]通過睪丸接種與皮內接種進行比較探究了兩者對梅毒兔模型的影響，結果顯示睪丸內接種的兔出現早期反應更加劇烈，全身損害的比率更高。國內研究者對睪丸內注射方法和皮下注射方法進行對比，發現前者TPPA、RPR轉陽時間較早，RPR滴度較高，臨床癥狀發生率高[17]。