水飛薊素灌胃對糖尿病腎病大鼠腎損傷的改善作用及其機制

翁雅琴，張紅，徐文東，石敏，張日東，李偉

(1徐州醫科大學，江蘇徐州221000；2南京醫科大學附屬淮安第一醫院；3 徐州醫科大學附屬醫院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者的微血管并發癥，是發達國家終末期腎病(ESRD)的最常見原因，在發展中國家的患病率和死亡率也在急劇上升[1，2]。DN病理改變包括腎小球和腎小管肥大、基底膜增厚和系膜增生，最終進展為腎小球硬化和腎小管間質纖維化[3]。盡管目前對DN的治療取得了一定效果，例如嚴格血糖、血壓控制以及腎素-血管緊張素系統阻斷劑的使用，但這些方法依舊無法阻止DN的進展。越來越多的研究[4]表明，慢性低水平炎癥及纖維化在DN發生發展中起關鍵作用，并且是DN進展為ESRD的常見途徑。研究[5，6]顯示，在DN患者腎臟中存在顯著的巨噬細胞浸潤、黏附分子及炎癥細胞因子活化增加。因此，對抗炎機制的研究為DN提供了新的治療策略。天然黃酮木脂素類化合物水飛薊素(Silymari，Sly)是從菊科藥用植物中水飛薊提取出來的一種生物活性物質[7]。研究[8～10]表明，Sly具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗病毒和抗腫瘤等作用，已被應用于肝病的治療。目前，國內外對于藥用植物對腎臟的保護作用給予了更多關注。研究[11，12]發現，Sly可以有效減少2型糖尿病腎病患者的蛋白尿水平，但具體機制并不明確。2017年4月～2017年7月，本研究通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導制備DN大鼠模型，在此基礎上給予Sly灌胃治療，并觀察大鼠腎組織病理形態變化和血清炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及腎小管CD14表達變化，判斷Sly對DN大鼠腎損傷的改善作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 大鼠、試劑及儀器 SPF級8周齡健康雄性SD大鼠40只，體質量180～200 g，均購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2013-0016。Sly、STZ購自美國Sigma公司。大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)ELISA試劑盒購自奧地利Bender MedSystems GmbH公司。CD14一抗購自美國CST公司；山羊抗兔二抗購自南京優寧維公司。歐姆龍血糖儀HEA-230、歐姆龍血糖試紙HEA-STP30購自歐姆龍健康醫療(中國)有限公司。FA2004電子天平購自上海上平儀器有限公司。奧林帕斯DX45顯微鏡、DP72相機購自美國熱電MK3酶標儀。

1.2 大鼠分組、DN模型制備、Sly灌胃方法及標本留取 大鼠在室溫21～27 ℃、濕度40%～70%環境下，飼養在12 h自然光照交替的屏障系統內，進食、飲水隨意并保持墊料干燥。大鼠經適應性飼養1周后, 將40只SD大鼠隨機分為4組(每組10只)：糖尿病腎病組(DN組)、水飛薊素低劑量治療組(Sly-L組)、水飛薊素高劑量治療組(Sly-H組)、對照組。制備模型前，大鼠予以禁食12 h，測空腹血糖(FPG)，選取FPG<8.9 mmol/L的大鼠制備模型。DN組、Sly-L組、Sly-H組均采用STZ誘導制備DN大鼠模型：腹腔一次性注射STZ溶液，注射體積1 mL/100g，注射劑量60 mg/kg。模型制備72 h后測FPG，FPG≥16.65 mmol/L表示模型制備成功。經檢測，DN組、Sly-L組、Sly-H組大鼠均符合要求。對照組大鼠腹腔一次性注射等體積0.1 mol/L枸櫞酸緩沖溶液(pH 4.5)。模型制備成功后，Sly-L組大鼠每24 h給予低劑量Sly(60 mg/kg)灌胃1次，Sly-H組大鼠每24 h給予高劑量Sly(120 mg/kg)灌胃1次，DN組、對照組給予等量生理鹽水灌胃。各組大鼠灌胃8周后，采用代謝籠收集24 h尿液，取空腹鼠尾靜脈血及眼眶血，然后處死大鼠，處死大鼠后迅速切取兩側腎臟，使用預冷生理鹽水灌洗去除殘留血液，濾紙吸干后備檢。

1.3 各組大鼠FPG、尿白蛋白/肌酐比值(UACR)、體質量、腎臟指數(KI)測算 ①取鼠尾靜脈血檢測FPG。②取代謝籠收集的大鼠24 h尿液，采用雙縮脲比色法測定24 h尿白蛋白和肌酐，計算UACR。③稱取處死后大鼠體質量。④取切除的大鼠雙腎稱重，計算KI。KI=大鼠腎臟重量/大鼠體質量。

1.4 各組大鼠血清炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6檢測 采用ELISA法。取大鼠眼眶血，分離血清，3 000 rpm離心5 min，取上清，采用ELISA試劑盒檢測，實驗過程中嚴格按試劑盒說明書操作。利用酶標儀在450 nm波長處檢測各組吸光度值，得出標準曲線，計算各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6濃度。

1.5 各組大鼠腎組織病理形態學檢查 采用HE染色。取右腎組織用10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制備4～5 μm厚連續切片，HE染色后，光學顯微鏡下觀察。

1.6 各組大鼠腎小管CD14檢測 采用免疫組織化學法。取各組右腎組織石蠟切片，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇浸泡 5 min，雙蒸水沖洗5 min除去乙醇，抗原修復，去離子水孵育10 min，BSA封閉15 min，與兔抗CD14一抗一起4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫1 h，用相對應的二抗室溫孵育15 min。應用新鮮配置的DAB顯色，并在 200倍顯微鏡下隨機選取腎臟皮質區10個視野，采用Image pro plus 6.0圖像分析系統觀察，檢測腎小管CD14陽性細胞(腎細胞胞質中CD14呈棕黃色為陽性)的累積光密度(IOD)值，以IOD值表示CD14的相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠FPG、UACR、體質量、KI比較 如表1所示，與對照組相比，DN組、Sly-L組及Sly-H組大鼠FPG、UACR、KI水平顯著升高(P均<0.01)，體質量顯著降低(P均<0.01)。與DN組相比，Sly-L組、Sly-H組大鼠FPG、UACR、KI水平均顯著降低(P均<0.05)。

表1 各組大鼠FPG、UACR、體質量、KI比較

注：與對照組相比，*P<0.01；與DN組相比，#P<0.05。

2.2 各組大鼠腎組織病理形態學變化 對照組腎小球以及腎小管形態結構正常，腎小球體積及細胞數目無明顯改變，毛細血管腔及球囊腔可見，腎小球系膜基質完整，基底膜未見增厚，腎小管上皮細胞無明顯變性、壞死，管腔內無管型；DN組腎小球體積增大，部分腎小管管腔輕度或中度擴大，腎小管上皮細胞空泡樣變性，可見炎性細胞浸潤；與DN組相比，Sly-L組及Sly-H組腎小管和腎小球病理損傷減輕,見圖1。

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及腎小管CD14比較 與對照組相比，DN組、Sly-L組血清TNF-α、IL-1β、IL-6及腎小管CD14均顯著升高(P均<0.05)，Sly-H組血清IL-6水平顯著升高(P<0.05)。與DN組相比，Sly-L組、Sly-H組血清TNF-α、IL-1β、IL-6及腎小管CD14均顯著降低(P均<0.05)。與Sly-L組相比，Sly-H組血清TNF-α、IL-1β、IL-6及腎小管CD14均顯著降低(P均<0.05)。見表 2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及腎小管CD14比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與DN 組相比，#P<0.05；與Sly-L組相比，☆P<0.05。

3 討論

Sly是從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取出來的一種黃酮木脂素類化合物，因其具有抗炎、抗氧化及促進細胞再生的作用，被廣泛應用于臨床肝病的治療[7]。最近的研究[13]表明，Sly還具有防治糖尿病、抗腎小管間質纖維化等作用。目前，用于治療糖尿病及其并發癥的傳統藥物均可引起嚴重的不良反應，因此，探索新的治療干預措施十分必要。近幾十年來，天然化合物Sly在DN中的作用受到國內外越來越多的關注，但Sly的具體作用機制并不十分清楚。Sheela等[14]應用STZ和煙酰胺誘導制備DN大鼠模型，接受Sly治療組大鼠血糖、糖化血紅蛋白、尿白蛋白水平均顯著降低，組織病理學評估顯示病理損傷減少。本研究中，DN組大鼠FPG、UACR、KI水平顯著升高，體質量明顯減輕，經過Sly治療后，FPG、UACR、KI水平顯著顯著降低，但體質量較DN組無明顯改變。此外，腎組織病理形態學檢查發現DN組大鼠腎小球體積增大，上皮細胞排列紊亂，腎小管呈空泡樣變性，并可見炎性細胞浸潤，而Sly-L組、Sly-H組大鼠腎組織病理改變較DN組明顯好轉。上述結果提示，Sly對DN大鼠腎組織損傷具有一定改善作用。

DN發生機制主要包括腎小球高濾過引起的腎小球囊內壓升高、炎癥、氧化應激、晚期糖基化終末產物(AGEs)的堆積、多元醇和蛋白激酶C(PKC)途徑的活化、轉化生長因子-β(TGF-β)的過度表達[3]。DN發病機制復雜，到目前為止尚未完全闡明。最近研究[15]表明，慢性低水平的炎癥在DN發生發展中起關鍵作用。在調節DN炎癥反應的炎癥細胞中，巨噬細胞發揮著重要作用。臨床及動物研究[16]顯示，腎組織巨噬細胞異常浸潤、募集與活化能夠導致腎臟免疫炎性損傷，腎組織巨噬細胞浸潤程度與腎臟病理學損害、蛋白尿水平、腎小球硬化、腎臟纖維化密切相關。DN高糖狀態下，AGEs異常蓄積，導致腎臟固有細胞或巨噬細胞活化，活化的巨噬細胞能夠釋放大量促纖維化因子及促炎癥因子加重腎損害。CD14屬于細胞表面糖蛋白家族成員，是革蘭陰性細菌細胞壁成分脂多糖(LPS)的受體，主要表達在單核-巨噬細胞表面。研究[17]顯示，CD14可通過脂多糖結合蛋白(LBS)與LPS特異性結合，并通過Toll樣受體4以及MD2蛋白向下游傳遞活化信號，啟動單核-巨噬細胞系統，并釋放多種趨化因子及炎癥細胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1、轉化生長因子、基質金屬蛋白酶、轉化生長因子-β(TGF-β)、血小板衍化生長因子(PDGF)等，進一步激活NF-κB，進而通過一系列途徑促進DN的發生發展。研究[18]表明，Sly能夠通過抗炎作用發揮腎保護作用，但具體機制并不十分清楚。炎癥細胞因子如TNF-α、1L-6、1L-1β在DN發病機制中起重要作用[19]。高血糖可直接刺激腎小球系膜細胞增生，刺激炎癥因子分泌，導致腎臟損傷；另外可通過激活單核-巨噬細胞等，刺激炎癥細胞因子如 TNF-α、1L-6、1L-1β釋放增加，反過來刺激巨噬細胞產生及腎臟固有細胞炎癥損傷，刺激趨化因子、黏附分子、致纖維化因子TGF-β等表達增加，激活NF-κB核轉移，正反饋促進炎癥相關因子的表達，導致炎癥反應擴大[20]。這些炎癥細胞因子激活促使腎小球系膜細胞分泌增多，導致系膜外基質(ECM)大量堆積，最終導致腎臟纖維化。Fallahzadeh等[21]研究發現Sly可以減少DN患者尿白蛋白排泄，并能夠減少TNF-α和丙二醛等炎癥細胞因子的表達，顯示出Sly具有一定的腎臟保護作用，且可能與抑制炎癥反應及NF-κB有關。本研究結果顯示，DN組大鼠血清炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平和腎小管CD14表達水平顯著升高，而在Sly治療后，大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和腎小管CD14CD14表達顯著降低，且Sly-H組下降更明顯，提示Sly可能通過減少巨噬細胞浸潤從而抑制炎癥反應發揮保護DN的作用，并可能存在一定劑量依賴性。

綜上所述，Sly可改善DN大鼠腎損傷，降低DN大鼠血清炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平并抑制腎小管CD14的表達可能是其作用機制。Sly在DN治療中具有較好的應用前景，但仍有待進一步深入研究。