去甲基化酶ALKBH5高、低表達(dá)食管鱗癌細(xì)胞株的構(gòu)建

方婷曉，翟堅(jiān)學(xué)，林桃燕，別亞男，肖東，蔡開燦

(1 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州510515；2 南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所；3 南方醫(yī)科大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所暨實(shí)驗(yàn)動物中心)

食管癌是一種惡性腫瘤,其發(fā)病率在全部惡性腫瘤中排第9位[1]。目前我國每年新發(fā)食管癌病例47.7萬，死亡病例37.5萬[2]。食管癌分為鱗癌和腺癌兩種類型，其中90%以上為食管鱗癌(ESCC)[3]。由于許多食管癌患者發(fā)現(xiàn)的時候已經(jīng)是中晚期，因此，研究ESCC的相關(guān)分子標(biāo)志物，找到相關(guān)靶點(diǎn)來預(yù)測ESCC的發(fā)展和預(yù)后顯得非常重要。RNA修飾是一種極為重要的基因表達(dá)過程調(diào)節(jié)方式，參與真核生物的多種病理生理過程[4]。N6-甲基腺苷化修飾(N6-methyladenosine，m6A)是一種極為常見的RNA甲基化修飾，參與真核生物mRNA的運(yùn)輸、剪切、翻譯及加工等過程，它的異常變化常常導(dǎo)致相應(yīng)下游靶蛋白的變化，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[5]。ALKBH5是m6A的一個去甲基化酶，是Alk B家族成員之一，亦是肥胖相關(guān)基因(FTO)的同源物[6]。研究[7～10]顯示，ALKBH5與乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和胰腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。但是目前有關(guān)ALKBH5在ESCC中作用的研究較少。本研究通過慢病毒感染技術(shù)，構(gòu)建了高、低表達(dá)ALKBH5的ESCC細(xì)胞株，為進(jìn)一步探討ALKBH5在ESCC中的調(diào)控作用提供細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及試劑 ESCC細(xì)胞株(Eca109細(xì)胞、Kyse510細(xì)胞、TE-13細(xì)胞)由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院李雋教授惠贈，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM。人源胚胎腎細(xì)胞293T 來源及培養(yǎng)方法見文獻(xiàn)[11]。高表達(dá)ALKBH5的質(zhì)粒pLV-ALKBH5及對照質(zhì)粒pLV-con購自廣州復(fù)能基因有限公司，上述2個質(zhì)粒中均帶有GFP蛋白和Flag標(biāo)簽蛋白，用于后續(xù)感染細(xì)胞的篩選。低表達(dá)ALKBH5的質(zhì)粒pLKO-shALKBH5-1、pLKO-shALKBH5-2(考慮到不同的干擾序列可能干擾效果不同，本實(shí)驗(yàn)選用了兩個干擾序列進(jìn)行了兩個位點(diǎn)的干擾)及對照質(zhì)粒pLKO-shSCR由美國哈佛醫(yī)學(xué)院施揚(yáng)教授惠贈[12]，上述3個質(zhì)粒中均帶有嘌呤霉素抗性，用于后續(xù)感染細(xì)胞的篩選。慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G由瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)Didier Trono博士惠贈。質(zhì)粒提取及純化試劑盒購自QIAGEN公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Corning公司。胰蛋白酶購自Gibco BRL公司。TRIzol、PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量 PCR 試劑盒均購自TaKaRa公司。蛋白分子量Marker購自Thermo公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 2000、RIPA 裂解液、高糖DMEM、Opti-MEM I Medium購自 Invitrogen公司。ALKBH5抗體(ABE547)購自MILLIPORE公司。內(nèi)參GAPDH 抗體(10494-1-AP)購自武漢三鷹Proteintech公司。FLAG抗體(F1804)購自Sigma公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(BS13278)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(BS12478)購自Bioworld公司。

1.2 293T細(xì)胞分組和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，分別記為A、B、a、b、c組，待細(xì)胞融合80%～90%后，按照質(zhì)量比pMD2.G∶psPAX2∶目的質(zhì)粒=8∶15∶20的比例進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。A組293T細(xì)胞用pLV-ALKBH5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，B組293T細(xì)胞用pLV-con質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，a組293T細(xì)胞用pLKO-shALKBH5-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，b組293T細(xì)胞用pLKO-shALKBH5-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，c組293T細(xì)胞用pLKO-shSCR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后收集各組病毒上清，3 000 rpm離心15 min，用0.45 μm濾器過濾后分裝于1.5 mL離心管。

1.3 高表達(dá)ALKBH5的ESCC細(xì)胞株的構(gòu)建 分別用A、B組細(xì)胞上清液感染Eca109細(xì)胞和Kyse510細(xì)胞，感染6～8 h后用含10% FBS的DMEM換液1次，48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察。pLV-ALKBH5質(zhì)粒和pLV-con質(zhì)粒攜帶的GFP蛋白在倒置熒光顯微鏡下為綠色熒光，觀察到綠色熒光說明細(xì)胞感染成功。選取各組感染成功的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)篩選GFP蛋白(+)的細(xì)胞待測。

1.4 低表達(dá)ALKBH5的ESCC細(xì)胞株的構(gòu)建 分別用a、b、c組細(xì)胞上清液感染Eca109細(xì)胞和TE-13細(xì)胞，感染6～8 h后用含10% FBS的DMEM換液1次，待細(xì)胞融合60%～70%時用嘌呤霉素篩選細(xì)胞，選取篩選2周后仍然處于良好生長狀態(tài)的細(xì)胞待測。

1.5 分別感染高、低表達(dá)ALKBH5的293T細(xì)胞上清液的ESCC細(xì)胞中ALKBH5 mRNA和蛋白的檢測 ①采用qRT-PCR法檢測ALKBH5 mRNA。收集各組細(xì)胞，TRIzol提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：ALKBH5 上游引物為5′-CGGCGAAGGCTACACTTACG-3′，下游引物為5′-CCACCAGCTTTTGGATCACCA-3′；GAPDH 上游引物為5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游引物為5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3′。建立10 μL PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μL、SYBR Green 5 μL、ddH2O 3 μL、上下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，40 個循環(huán)(95℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s)。以 2-ΔΔCt表示ALKBH5 mRNA 的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。②采用Western blotting法檢測ALKBH5蛋白。收集細(xì)胞并提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，蛋白變性后上樣，恒壓電泳和恒流轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，封閉后將帶有目的蛋白的條帶放在裝有一抗的抗體孵育盒中，將盒子置于4 ℃冰箱慢搖過夜，次日拿出室溫慢搖30 min后回收一抗，PBS清洗3次，每次10 min，然后二抗孵育條帶1 h，再次用PBS清洗3次，每次10 min，最后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯像，用image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算受檢蛋白的相對表達(dá)量。受檢蛋白的相對表達(dá)量=受檢蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

分別感染高、低表達(dá)ALKBH5細(xì)胞上清液的ESCC細(xì)胞中ALKBH5 mRNA和蛋白的檢測結(jié)果顯示，感染A組細(xì)胞上清液的Eca109細(xì)胞、Kyse510細(xì)胞中ALKBH5 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均顯著高于感染B組細(xì)胞上清液的Eca109細(xì)胞、Kyse510細(xì)胞(P均<0.05)，感染a、b組細(xì)胞上清液的Eca109細(xì)胞、TE-13細(xì)胞中ALKBH5 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均顯著低于感染c組細(xì)胞上清液的Eca109細(xì)胞、TE-13細(xì)胞(P均<0.05)。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建高、低表達(dá)ALKBH5的ESCC細(xì)胞株，詳見表1、2。

表1 感染高表達(dá)ALKBH5細(xì)胞上清液的ESCC細(xì)胞中ALKBH5 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量比較

注：與B組相比，﹡P<0.05。

表2 感染低表達(dá)ALKBH5細(xì)胞上清液的ESCC細(xì)胞中ALKBH5 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量比較

注：與c組相比，﹟P<0.05。

3 討論

RNA表觀遺傳學(xué)修飾是轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控方式，目前已鑒定了150多種修飾類型，它們分布于轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、mRNA、非編碼小RNA和長鏈非編碼RNA上，其中m6A是最常見的一種發(fā)生在真核生物mRNA上的RNA修飾[13～19]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，證實(shí)轉(zhuǎn)錄本的m6A修飾水平受編碼器(甲基轉(zhuǎn)移酶)、讀碼器(結(jié)合蛋白)和消碼器(去甲基化酶)的動態(tài)調(diào)控，表明RNA的m6A修飾是一個動態(tài)可逆的過程[19]。作為真核生物mRNA上除了5′帽子結(jié)構(gòu)外最多的轉(zhuǎn)錄后修飾，m6A成為近年來RNA研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。m6A修飾受特異性的甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶動態(tài)調(diào)控，進(jìn)而影響干細(xì)胞的多能性和分化[7～10]。近年來，隨著m6A第一個去甲基化酶FTO的發(fā)現(xiàn)，首次證實(shí)了RNA修飾存在可逆性，擴(kuò)大了表觀基因組學(xué)的豐富程度[20]。研究[13]顯示，m6A可通過去甲基化酶FTO和ALKBH5可逆性調(diào)節(jié)去甲基。FTO和ALKBH5均是Alk B家族成員，其中ALKBH5可催化m6A去甲基化。

研究[7～10,18]顯示，ALKBH5的沉默除了會影響mRNA的核輸出及精子形成外，還與乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和胰腺癌的進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究[7]發(fā)現(xiàn)，ALKBH5在乳腺癌樣干細(xì)胞中高表達(dá)，且與NANOG基因協(xié)同表達(dá)，高表達(dá)ALKBH5可以增加NANOG的蛋白水平和穩(wěn)定性，提示ALKBH5可以影響NANOG mRNA的去甲基化或者對NANOG mRNA m6A水平有間接的影響。研究[7]同時證明，抑制ALKBH5或缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)，可以激活缺氧乳腺癌細(xì)胞中ALKBH5的表達(dá)，同時減少NANOG表達(dá)，并在體內(nèi)靶向乳腺癌樣干細(xì)胞。另一項(xiàng)研究[9]表明，ALKBH5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣干細(xì)胞中高表達(dá)，生存分析提示ALKBH5是神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的負(fù)性預(yù)后因子，沉默ALKBH5可抑制干細(xì)胞增殖和腫瘤形成。為進(jìn)一步探討ALKBH5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用，研究[9]還進(jìn)行了微陣列分析和m6A 的高通量測序，在沉默ALKBH5的細(xì)胞中下調(diào)的206個基因中篩選出13個與表型及增殖相關(guān)的候選基因，進(jìn)行分析并篩選出轉(zhuǎn)錄因子FOXM1，提示ALKBH5可以通過影響FOXM1的去甲基化來影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣干細(xì)胞的增殖。He等[10]最新研究表明，高表達(dá)ALKBH5可以抑制胰腺癌的侵襲和遷移，并首次發(fā)現(xiàn)ALKBH5可以通過下調(diào)長鏈非編碼RNA KCNK15-AS1的甲基化來抑制胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。以上研究均提示ALKBH5有可能成為新的抗癌靶點(diǎn)，為癌癥的診斷及預(yù)后判斷提供新的依據(jù)，但是具體的分子機(jī)制和生物學(xué)功能還有待闡明。

縱觀現(xiàn)有文獻(xiàn)，ALKBH5尚未在ESCC有過相關(guān)的研究，本課題組前期通過20例臨床標(biāo)本檢測得到，ALKBH5在ESCC中普遍低表達(dá)，故本研究基于此基礎(chǔ)，構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的ALKBH5高、低表達(dá)的ESCC細(xì)胞株。本研究預(yù)測，高表達(dá)ALKBH5之后，ESCC的增殖能力可能會減弱，侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱，同時將會抑制ESCC干細(xì)胞的生長，腫瘤球數(shù)量變少，干細(xì)胞的一系列標(biāo)志蛋白和mRNA水平可能會上升；干擾ALKBH5之后，ESCC的增殖可能會加快，侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，同時促進(jìn)ESCC干細(xì)胞的生長，腫瘤球數(shù)量變多，直徑更大，干細(xì)胞的一系列標(biāo)志蛋白和mRNA水平可能會下調(diào)。

綜上所述，為進(jìn)一步闡明ALKBH5在食管鱗癌中的生物學(xué)作用及機(jī)制，本研究分別將高表達(dá)ALKBH5的質(zhì)粒pLV-ALKBH5和低表達(dá)ALKBH5的質(zhì)粒LKO-shALKBH5-1、LKO-shALKBH5-2感染ESCC細(xì)胞株，成功構(gòu)建高、低表達(dá)ALKBH5的ESCC細(xì)胞株，為進(jìn)一步探討ALKBH5在ESCC發(fā)生發(fā)展中的作用提供了細(xì)胞模型。