2016～2017年北京地區(qū)非結(jié)核分枝桿菌菌種分布觀察

張潔，王嫩寒，易俊莉，楊新宇，任怡宣，齊紅偉，張宗德

(1 北京結(jié)核病控制研究所，北京100035；2 北京市紅十字血液中心；3 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院)

分枝桿菌屬群中，除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)和麻風(fēng)分枝桿菌外，其余分枝桿菌統(tǒng)稱為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。NTM種類繁多，在自然界中廣泛存在，但一些菌種會(huì)導(dǎo)致危及人類生命的疾病，死亡率很高[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，免疫力低下的人更容易患NTM病，但患有慢性肺基礎(chǔ)疾病的免疫力強(qiáng)的人也可感染NTM病。NTM病的發(fā)病率和流行率在全球范圍內(nèi)不斷上升。NTM病臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特點(diǎn)與結(jié)核分枝桿菌病極為相似，但治療方案卻大不一樣，因此，把分枝桿菌快速準(zhǔn)確的鑒定至菌種水平是診斷和治療各種分枝桿菌病的關(guān)鍵。采用生化試驗(yàn)鑒定分枝桿菌的技術(shù)是分枝桿菌菌種鑒定的經(jīng)典方法，但由于其操作復(fù)雜、耗時(shí)長且結(jié)果不準(zhǔn)確，現(xiàn)已不常使用。微陣列基因芯片技術(shù)將大量的核酸分子預(yù)先設(shè)計(jì)在固定的載體上，同時(shí)檢測、分析大量的DNA或RNA，是一種大規(guī)模分析遺傳差異的新方法，已廣泛應(yīng)用于分枝桿菌菌種的鑒定。本研究采用微陣列基因芯片法對2016～2017年北京地區(qū)分離出來的67株NTM菌株進(jìn)行菌種鑒定，觀察其菌種分布情況，從而為北京市NTM病臨床診斷和治療提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取北京結(jié)核病控制研究所2016～2017年分離出的NTM菌株67株，均經(jīng)PCR-熒光探針法鑒定為NTM。67株NTM均分離自臨床患者，同一患者的多份菌株標(biāo)本按一份算。67例NTM分離患者中，男41例、女26例，男女比例為1.58∶1；15～30歲者13例，男13例、女0例；30～45歲者9例，男4例、女5例；45～60歲者7例，男2例、女5例；年齡>60歲者38例，男22例、女16例。

1.2 細(xì)菌、試劑與儀器 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv由國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(微陣列基因芯片法)、核酸提取儀ExtractorTM36、晶芯微陣列芯片掃描儀RLuxScanTM10K-B、晶芯芯片雜交儀BioMixerTMⅡ、晶芯SlideWasherTM8芯片洗干儀均購自博奧生物有限公司。Sigma 3K15低溫高速離心機(jī)、PTC200 PCR擴(kuò)增儀購自MJ公司。

1.3 菌種鑒定方法 在核酸提取管中加入50 μL核酸提取液，挑取單個(gè)菌落，放入核酸提取儀，最大轉(zhuǎn)速振蕩5 min后95 ℃水浴5 min，3 000×g離心2 min， -20 ℃保存。將2 μL提取出來的DNA加入至18 μL PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件：37 ℃ 10 min；94 ℃ 10min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s、72 ℃ 60s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物放置于PCR擴(kuò)增儀中95 ℃變性5 min，然后立即置于冰水混合物中冰浴3～5 min，從蓋片的加樣孔中加入14 μL雜交反應(yīng)物，蓋上雜交盒并密封，將密封好的雜交盒水平放入50 ℃的恒溫水浴鍋中120 min進(jìn)行芯片雜交。每個(gè)微陣列只能加1份樣品，記錄芯片的編號、微陣列位置以及對應(yīng)的樣本編號。待雜交反應(yīng)結(jié)束后，將芯片從雜交盒中取出，用十二烷基硫酸鈉洗液和檸檬酸鈉洗液沖洗干凈，甩干后放入芯片掃描儀，用晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測芯片判別系統(tǒng)判讀芯片結(jié)果。檢測NTM的微陣列芯片探針排布見圖1。

12345 6789101表面化學(xué)質(zhì)控探針雜交陽性外對照探針2空白對照探針內(nèi)對照探針(分枝桿菌屬)3結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)分枝桿菌4鳥分枝桿菌戈登分枝桿菌5堪薩斯分枝桿菌偶然分枝桿菌6瘰疬分枝桿菌淺黃分枝桿菌7土分枝桿菌龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌8草分枝桿菌不產(chǎn)色分枝桿菌9海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌金色分枝桿菌10蘇爾加分枝桿菌和瑪爾摩分枝桿菌蟾蜍分枝桿菌11恥垢分枝桿菌陰性對照探針12雜交陽性外對照探針表面化學(xué)質(zhì)控探針

圖1 檢測NTM的微陣列芯片探針排布示意圖

2 結(jié)果

67株NTM菌株中經(jīng)鑒定確定的菌種有11種，胞內(nèi)分枝桿菌最多，占40.3%(27/67)，堪薩斯分枝桿菌占13.4%(9/67)，偶然分枝桿菌占11.9%(8/67)，鳥分枝桿菌占10.4%(7/67)，龜-膿腫分枝桿菌占7.5%(5/67)，恥垢分枝桿菌和戈登分枝桿菌各占3.0%(2/67)，草分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、土分枝桿菌各占1.5%(1/67)，不在檢測范圍內(nèi)無法判讀的菌株3株,占4.5%。部分NTM菌株微陣列輸出圖譜見圖2。

3 討論

研究[3]發(fā)現(xiàn)，在世界范圍內(nèi)NTM肺部疾病的發(fā)病率不斷上升。NTM肺部疾病通常是慢性的，治療過程漫長，即使在治療成功后，再次感染的風(fēng)險(xiǎn)也很高。繼往認(rèn)為NTM不具有傳染性，但近期文獻(xiàn)[4]提示NTM可能具有傳染性，且其診斷的困難性、高度耐藥性和復(fù)發(fā)性都是導(dǎo)致其危害嚴(yán)重的原因。我國第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，NTM在分枝桿菌分離株中占22.9%(83/363)，調(diào)查數(shù)據(jù)比1990年(占4.9%)和2000年(占11.1%)全國流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果明顯升高。研究[5]發(fā)現(xiàn)，NTM感染率和流行情況有著明顯的地區(qū)差異,且與氣候環(huán)境相關(guān)，歐美等國家多以堪薩斯分枝桿菌和蟾蜍分枝桿菌為主要分離菌種,伊朗呼吸道標(biāo)本中分離出來的最常見的NTM菌種為猿猴分枝桿菌。研究[6]結(jié)果顯示，我國分離出來最多的NTM菌種為胞內(nèi)分枝桿菌，在北方可達(dá)40%～60%，而南方地區(qū)除了胞內(nèi)分枝桿菌外，膿腫分枝桿菌也占較高比例，與北方相比，南方NTM菌種更具有多樣性。本研究鑒定出來的67株NTM中包含了11個(gè)菌種，數(shù)量前5位的菌種分別為胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、鳥分枝桿菌、龜-膿腫分枝桿菌，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

本研究67例NTM分離患者中，NTM分離率男性高于女性,男女性別比例為1.58∶1,與報(bào)道[7]廣州男性NTM感染率高一致。本研究67例NTM分離患者中，15～30歲男女比例差異較大(13∶0)，我們分析可能與該年齡段男性外出打工及外出求學(xué)比例較高有關(guān)。NTM是條件致病菌，其致病性遠(yuǎn)低于結(jié)核分枝桿菌，免疫力下降是NTM的主要易感因素。我們的研究結(jié)果也顯示，60歲以上人群是NTM的分離主體，提示中老年人群可因免疫力下降而導(dǎo)致NTM感染率增高。

根據(jù)生化實(shí)驗(yàn)和鑒別培養(yǎng)基來進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定的方法操作繁瑣、效率低，鑒定快速生長型分枝桿菌需1～2周，鑒定緩慢生長型分枝桿菌需4～8周，鑒定結(jié)果還容易受多種條件的影響，可靠性差，而且不能完全將全部NTM菌種鑒定出來，已經(jīng)難以滿足臨床需求。近年來，以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法鑒定分枝桿菌菌種已被國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室采用，結(jié)果顯示，分子生物學(xué)方法鑒定分枝桿菌更簡便、快速，與傳統(tǒng)方法可相互補(bǔ)充，對提高分枝桿菌的正確診斷率、指導(dǎo)臨床合理用藥有重要意義。本研究采用的微陣列基因芯片技術(shù)是DNA雜交技術(shù)和PCR不對稱擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合的分子診斷方法，具有很好的特異性和敏感性，快速、操作簡單,能同時(shí)檢測臨床上常見分枝桿菌的17個(gè)菌種，可以在2個(gè)工作日內(nèi)得到檢測結(jié)果，且芯片上設(shè)有多種質(zhì)控探針，具有很好的質(zhì)量控制，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]。微陣列基因芯片法檢測的對象是DNA片段，無須接觸活菌，生物安全性較高，另外，通過軟件自動(dòng)判讀結(jié)果，操作簡便，自動(dòng)化程度高，可減少人為誤差，便于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測。通過2年的數(shù)據(jù)積累，我們也看到，本研究67株NTM中還有3株病菌不在檢測范圍內(nèi)，無法鑒定到種屬，說明微陣列基因芯片技術(shù)還存在一定的局限性，對于不常見的分枝桿菌的檢測還有待開發(fā)；對于種內(nèi)序列差異較大的分枝桿菌，應(yīng)增加分子標(biāo)識(shí)的檢測數(shù)量以提高分辨率和檢出率；單一的DNA同源序列分辨力不足，一些親緣關(guān)系相近的分枝桿菌無法被準(zhǔn)確鑒別，如無法準(zhǔn)確區(qū)分具有臨床診斷價(jià)值的龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌和瑪爾摩分枝桿菌。

綜上所述，2016～2017年北京地區(qū)NTM菌種分布達(dá)11個(gè)種，以胞內(nèi)分枝桿菌最多。隨著結(jié)核分枝桿菌病的逐步可控，NTM病的臨床診斷及治療已經(jīng)成為越來越突出的問題，分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展和成熟為NTM的快速、高效檢測提供了一個(gè)新的發(fā)展契機(jī)，需要實(shí)驗(yàn)室人員及臨床醫(yī)務(wù)人員的不斷關(guān)注。