食管癌甲基化驅(qū)動基因的篩選、功能及調(diào)控通路分析

謝俞寧，仵紅嬌，楊振邦，高慧，侯俊志，張雪梅

(華北理工大學，河北唐山063210)

在全球范圍內(nèi)，食管癌的新發(fā)病例每年約48萬例，其癌癥致死率排第6位[1]。隨著生命科學技術(shù)的發(fā)展，特別是二代測序技術(shù)的推廣，加深了我們對食管癌基因組特點的理解。研究[2]發(fā)現(xiàn)，繼基因突變和拷貝數(shù)變異之后，DNA甲基化是又一通過改變機體穩(wěn)態(tài)繼而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。目前，高通量甲基化數(shù)據(jù)已經(jīng)被廣泛深入研究，然而直接識別甲基化驅(qū)動基因的方法依舊十分缺乏。R語言中的MethylMix包基于β混合模型鑒定甲基化狀態(tài)，并與正常DNA甲基化狀態(tài)相比，使用差異甲基化值(DM值)來定義疾病DNA甲基化狀態(tài)與正常DNA甲基化狀態(tài)的差異，可將基因表達數(shù)據(jù)和甲基化數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，從而達到篩選甲基化驅(qū)動基因的目的[3]。本研究應用生物信息學方法篩選食管癌甲基化驅(qū)動基因，并進行功能及調(diào)控通路分析，為尋找食管癌潛在標志物提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取和預處理 搜集TCGA數(shù)據(jù)庫中基因表達數(shù)據(jù)、DNA甲基化數(shù)據(jù)、臨床信息完整的食管癌患者資料162例，記為腫瘤組；其中16例食管癌患者還有癌旁對照資料，記為對照組?；虮磉_數(shù)據(jù)為TCGA RNA-Seq Level 3數(shù)據(jù)，使用R語言edgR包對基因表達數(shù)據(jù)進行標準化處理；DNA甲基化數(shù)據(jù)由Illumina HumanMethylation 450 BeadChip測得，使用R語言Limma包對DNA甲基化數(shù)據(jù)進行芯片歸一化處理。162例食管癌患者中，白種人99例(占61.1%)，黃種人40例(占24.7%)，黑種人3例(占1.9%)，種族情況未知20例(占12.3%)。

1.2 食管癌甲基化驅(qū)動基因的篩選 使用R語言MethylMix包綜合分析兩組患者的基因表達數(shù)據(jù)和DNA甲基化數(shù)據(jù)。R語言MethylMix包定義腫瘤組和對照組甲基化平均值的差值倍數(shù)為DM值，Spearman相關(guān)分析法分析基因表達與甲基化相關(guān)性(P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義)，以|DM值|>0、|相關(guān)系數(shù)(Cor)|>0.3為截斷值篩選甲基化驅(qū)動基因[4]。

1.3 食管癌甲基化驅(qū)動基因功能及調(diào)控通路分析 使用在線分析軟件DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)對食管癌甲基化驅(qū)動基因進行基因本體(GO)功能富集分析。使用在線數(shù)據(jù)庫KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)對食管癌甲基化驅(qū)動基因進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析[5]。

2 結(jié)果

2.1 食管癌甲基化驅(qū)動基因篩選結(jié)果 篩選得到88個食管癌甲基化驅(qū)動基因，由DM值可見，其中74(84.1%)個為高甲基化驅(qū)動基因(DM值>0,Cor<0,P<0.05)，14個為低甲基化驅(qū)動基因(DM值<0,Cor<0,P<0.05)。74個高甲基化驅(qū)動基因分別為FERMT3、VSIG2、AC005498.3、HOXA13、ERN2、ECHDC3、ZNF568、USP44、ZKSCAN7、ZNF790、NME5、ZNF85、TMEM220、HOTTIP、SYCP2、NKAPL、ZNF69、HOXB-AS3、HOXB6、SERP2、ZNF880、ZNF583、ZNF582、PHYHD1、ZNF677、ZNF454、CCDC8、GDF6、ZNF300P1、CKMT2、LINC01354、SLC39A7、GALNT3、AMT、SOST、REC8、IGFBP2、TMEM129、HTR1B、ZNF738、IDH2、GSTM2、TSPY26P、BSG、MFAP4、ZNF334、DLX6、TRIM8、GPBAR1、EN1、CCDC181、RGS22、AF186192.1、HOXA7、LEAP2、PDPN、AC011239.2、MPC2、KLHDC7B、C19orf67、RNF5、HOXA-AS3、GPR25、GLDC、CEBPA-AS1、ABCC9、BCL6B、NKX6-1、EPHX3、GPR150、SOX1、FUT9、UQCRFS1、SLC10A4，14個低甲基化驅(qū)動基因分別為MKRN3、KRT5、CSAG1、MIR205HG、AIM2、LINC00898、TM4SF19、SOWAHC、VCX3A、AC016735.2、TTC30A、OLFM4、LRRIQ4、DAPP1。按照|cor|值由大到小進行排序，可見最可能(|cor|最大)出現(xiàn)甲基化的食管癌甲基化驅(qū)動基因有Makorin環(huán)指蛋白3(MKRN3)基因、人Fermitin家族同系物3(FERMT3)基因、含V-Set免疫球蛋白域蛋白2(VSIG2)基因等。

2.2 食管癌甲基化驅(qū)動基因的GO功能 在分子功能層面，食管癌甲基化驅(qū)動基因主要影響了金屬離子結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性、核酸結(jié)合；在生物學過程層面，食管癌甲基化驅(qū)動基因影響了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板化；在細胞成分層面，食管癌甲基化驅(qū)動基因影響了核組分、胞內(nèi)組分。同時，我們發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白家族如ZNF582、ZNF69、ZKSCAN7、ZNF583、ZNF568、ZNF454、ZNF790、ZNF880等和SOX1基因被富集在了多個GO中。在分子功能、生物學過程、細胞成分層面發(fā)揮不同功能的基因見表1。

表1 在分子功能、生物學過程、細胞成分層面發(fā)揮不同功能的基因

2.3 食管癌甲基化驅(qū)動基因的調(diào)控通路 KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，食管癌甲基化驅(qū)動基因主要參與了乙醛酸和二羧酸代謝通路(通路編號hsa00630)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路(通路編號hsa00260)，碳代謝通路(通路編號hsa01200)及谷胱甘肽代謝通路(通路編號hsa00480)的調(diào)控。

3 討論

我國是食管癌高發(fā)國家，每年新發(fā)病例數(shù)超過22萬例，90%的患者確診時已至中晚期，預后較差，食管癌負擔水平約為世界平均水平的2倍。DNA甲基化芯片具有高通量、高敏感性的優(yōu)勢，在疾病診斷學、組織學等多個領(lǐng)域中有著極為廣泛的應用[6]。本研究使用的Illumina HumanMethylation 450 BeadChip可以測到超過450 000個位點的DNA甲基化信息，覆蓋了多數(shù)CpG島和啟動子區(qū)。目前對DNA甲基化修飾的的挖掘方法主要是分別篩選差異表達基因和差異甲基化基因，對兩者取交集，尋找低甲基化高表達基因和高甲基化低表達基因作為可能受到甲基化修飾調(diào)節(jié)的基因，然后進行GO功能富集和KEGG通路分析，這種方法一定程度上忽略了基因表達與甲基化的相關(guān)關(guān)系。R語言MethylMix包首先考慮甲基化水平與基因表達的相關(guān)性，使用DM值來定義DNA的甲基化水平，構(gòu)建混合模型識別甲基化驅(qū)動基因，相比傳統(tǒng)方法具有優(yōu)越性。

本研究共篩選出88個食管癌甲基化驅(qū)動基因，最可能受甲基化調(diào)控的基因有MKRN3基因、FERMT3基因、VSIG2基因等。MKRN3基因與Prader-Willi綜合征有關(guān)，于2013年首次在5個有中樞性性早熟患者的家族研究[7]中發(fā)現(xiàn)。最近一些研究[8]表明，中樞性性早熟患者中，MKRN3、KISS1、KISS1R和DLK1等基因均發(fā)生了不同程度的突變，且中樞性性早熟與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是在食管癌患者中，對MKRN3基因的作用依然知之甚少。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MKRN3除通過基因突變影響其自身功能外，DNA甲基化修飾也可能發(fā)揮了重要作用。研究[9]結(jié)果顯示，F(xiàn)ERMT3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中通過整合素介導的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞活性，增強膠質(zhì)瘤細胞的存活和化療耐藥性。在一項有關(guān)結(jié)腸癌患者的研究[10]中，F(xiàn)ERMT3的過表達可導致食管癌細胞系增殖和侵襲能力增強。VSIG2基因目前僅在系統(tǒng)性紅斑狼瘡全基因組關(guān)聯(lián)研究[11]中有過報道，認為VSIG2單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的血清學特征有關(guān)，但其同家族基因VSIG4在肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，本研究中篩選其為甲基化驅(qū)動基因，或為VSIG2基因在食管癌中的研究提供新的思路。

通過GO功能富集分析，我們發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白家族中的食管癌甲基化驅(qū)動基因富集在了多個GO中。鋅指蛋白家族是人類基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，鋅指結(jié)構(gòu)基序的多樣化組合和功能使鋅指蛋白在生物過程中有多種用途，包括發(fā)育、分化、代謝和自噬。然而，鋅指蛋白家族在癌癥進展中的潛在機制在不同的癌癥類型中有所不同，甚至在相同的癌癥類型中也不一樣[12]。本研究提示，鋅指蛋白家族的甲基化修飾可能對食管癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。同樣，被富集在多個GO中的SOX1基因被認為是腫瘤抑制基因，其啟動子區(qū)域的高度甲基化被認為是其在鼻咽癌中低表達的原因。Lin等[13]通過體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn)，SOX1基因的過表達可抑制宮頸癌細胞增殖和侵襲，起腫瘤抑制劑的作用。同時，SOX1基因在卵巢癌中也發(fā)現(xiàn)了類似作用。通過檢索發(fā)現(xiàn)，SOX1在食管癌中的研究尚不充分，值得進行進一步的探究。

通過KEGG通路分析，我們發(fā)現(xiàn)食管癌甲基化驅(qū)動基因主要影響了代謝相關(guān)的多個通路。絲氨酸可以通過甲基轉(zhuǎn)移酶SHMT1(細胞質(zhì)內(nèi))和SHMT2(線粒體內(nèi))轉(zhuǎn)化為甘氨酸，最近的研究發(fā)現(xiàn)癌細胞需要SHMT(特別是SHMT2)以獲得最佳增殖和致瘤性，這表明絲氨酸代謝在癌癥發(fā)生發(fā)展中的重要性。碳代謝通路在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中意義重大。研究[14]谷胱甘肽(GSH)對細胞周期的調(diào)控至關(guān)重要，在肝癌細胞和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞中，癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移活性與谷胱甘肽表達呈現(xiàn)直接相關(guān)性。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中伴隨著代謝途徑的再編程，KEGG通路分析結(jié)果提示，腫瘤代謝再編程可能受到了甲基化修飾的調(diào)控。

綜上所述，食管癌甲基化驅(qū)動基因有88個，以高甲基化驅(qū)動基因為主；最可能發(fā)生甲基化調(diào)控的食管癌甲基化驅(qū)動基因有MKRN3基因、FERMT3基因、VSIG2基因等；食管癌甲基化驅(qū)動基因主要影響了金屬離子結(jié)合、DNA結(jié)合等分子功能，轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板化等生物學過程，核組分、胞內(nèi)組分等細胞成分；食管癌甲基化驅(qū)動基因主要影響了代謝相關(guān)的多個通路。本研究通過生物信息學方法，初步分析了食管癌甲基化驅(qū)動基因可能參與食管癌調(diào)控的基因和信號通路，為尋找食管癌潛在標志物提供依據(jù)。另外，本研究納入人群以白種人為主，可能無法很好的代表黃種人的實際基因表達水平和甲基化水平，后續(xù)仍需要在黃種人中進行驗證。