五味子甲素對人胰腺癌細胞株AsPc-1增殖、凋亡的影響及其機制

曾智銳，雷珊，張金娟，楊宇石，蘭金芝，陳騰祥，

(1 貴州醫科大學基礎醫學院，貴陽550004；2 貴州醫科大學臨床醫學院；3 貴州醫科大學貴州省再生醫學重點實驗室)

胰腺癌是常見消化系癌癥之一，惡性程度和致死率極高[1]。目前，胰腺癌的治療主要是手術聯合化療等綜合治療，但其復發率極高，療效較差[2]。因此，尋找新的治療方式及藥物對胰腺癌的治療有著重要的意義。五味子甲素是我國傳統中草藥五味子的提取物，具有抗炎、擴血管以及免疫抑制等作用。近年來研究[3]發現，五味子甲素可以抑制卵巢癌細胞的增殖，誘導其凋亡，是卵巢癌潛在的治療藥物。然而，五味子甲素對胰腺癌是否有相應的作用，目前還沒有相關研究。β-catenin蛋白是E-鈣黏蛋白家族成員之一，在腫瘤細胞中常表達上調，并轉位入核，作為轉錄因子調控腫瘤相關基因的異常表達。研究[4]結果顯示，β-catenin的下游靶基因有Myc、P21、Bcl2，其通過上調這些基因的轉錄表達，可增強腫瘤細胞增殖能力。β-catenin還可以調控E-cadherin蛋白、金屬蛋白酶家族成員MMP-7的表達，促進腫瘤細胞的細胞侵襲和遷移。研究[5]發現，β-catenin蛋白相對分子量大小約為92 kD，而進入細胞核的β-catenin可以進一步被水解成分子量大小約為78 kD的β-catenin蛋白水解片段，該水解片段具有比全長的β-catenin蛋白更高的轉錄活性,在腫瘤的發生發展中具有重要作用。2016年9月3日～2018年11月20日，本研究觀察了五味子甲素對人胰腺癌細胞AsPc-1增殖、凋亡的影響，并探討五味子甲素對胰腺癌細胞的調控機制。

1 材料與方法

1.1 五味子甲素、細胞及試劑 五味子甲素(純度>98%)購自武漢慧誠益通生物公司。人胰腺癌細胞株AsPc-1購自ATCC細胞庫。RPMI1640培養基、FBS血清購自Gibco公司，兔多克隆Bcl-2、bax、β-catenin抗體購自武漢三鷹技術有限公司，凋亡檢測試劑盒購自Minipore生物公司，CCK8檢測液、山羊抗鼠和山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物有限公司，曲拉通破膜液、BSA封閉液、山羊抗兔-CY3熒光二抗和抗熒光淬滅封片劑購自武漢塞維爾有限公司，ECL超敏曝光液購自武漢聚能生物有限公司。

1.2 五味子甲素藥液配制與細胞培養 五味子甲素溶于水，以PBS配制成5 mmol/L的母液，過濾除菌后，4 ℃保存備用。AsPc-1細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI1640培養基中，在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，隔天換液，待細胞融合度達75%～80%時，用0.25%的胰酶消化、傳代，取狀態良好的細胞用于實驗。

1.3 不同濃度五味子甲素對AsPc-1細胞增殖的影響觀察 ①采用CCK-8法測算細胞增殖率。AsPc-1細胞以5 000個/孔鋪入到96孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養箱中過夜，待細胞貼壁后，將AsPc-1細胞分為5組，分別加入12.5、25、50、100 μmol/L的五味子甲素藥液和等量培養基，記為12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組(觀察組)和對照組，每組設6個復孔。各組繼續培養48 h后棄掉培養基，加入含有10 μL CCK-8檢測液的新鮮培養基100 μL繼續培養2 h，以只加入含有10 μL CCK8檢測液的新鮮培養基100 μL的孔為空白組，在酶標儀450 nm處檢測各孔的OD值，計算各組細胞增殖率。各組細胞增殖率=(觀察組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。實驗重復3次，取平均值。②采用細胞平板克隆實驗檢測各組細胞克隆形成能力。AsPc-1細胞以800個/皿接種于培養皿中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養1 d，待細胞完全貼壁，分別加入100 μmol/L五味子甲素藥液和等體積PBS，記為五味子甲素組和對照組。各組繼續培養9 d，棄培養基，PBS洗滌3次，多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，結晶紫染色20 min，PBS洗掉殘余結晶紫染料，拍照后計算每個小皿形成的克隆數，以克隆數表示細胞克隆形成能力。實驗重復3次，取平均值。

1.4 五味子甲素對AsPc-1細胞凋亡的影響觀察 采用流式細胞術。AsPc-1細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養1 d，待細胞完全貼壁，分別加入100 μmol/L五味子甲素藥液和等體積PBS，記為五味子甲素組和對照組。各組繼續培養24 h，胰酶消化后取細胞置于流式管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗滌細胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書分別加入Annexin V和PI試劑對細胞進行染色，4 ℃避光放置30 min，流式細胞儀檢測。實驗重復3次，取平均值。

1.5 不同濃度五味子甲素對AsPc-1細胞β-catenin蛋白和凋亡相關蛋白Bcl2、Bax表達的影響觀察 采用Western blotting法。取AsPc-1細胞以5 000個/孔鋪入到96孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養箱中過夜，待細胞貼壁后，將AsPc-1細胞分為4組，分別加入25、50、100 μmol/L的五味子甲素藥液和等量培養基，記為25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組和對照組。將RIPA液、PMSF、磷酸化酶抑制劑及cocktail以100∶2∶2∶2比例混勻，配成細胞裂解液，分別加入到各組中，待各組細胞充分裂解后，收集到1.5 mL的EP管中，12 000 r/min離心15 min，取蛋白上清液，BCA定量后制備蛋白樣品，以每孔30 μg進行上樣，在聚丙烯酰胺凝膠中110 V恒壓電泳120 min，濕轉法轉印到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉PVDF膜2 h，分別加入兔Bcl2、Bax、β-catenin多克隆抗體和鼠源性GAPDH內參抗體孵育，4 ℃過夜，TBST洗滌后加入山羊抗兔(鼠)二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，滴加ECL超敏曝光液，在Biorad成像儀中暗室曝光，用Image pro plus軟件分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內參GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.6 五味子甲素對AsPc-1細胞β-catenin蛋白核定位的影響觀察 采用免疫熒光法。AsPc-1細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養1 d，待細胞完全貼壁，分別加入100 μmol/L五味子甲素藥液和等體積PBS，記為五味子甲素組和對照組。各組繼續培養24 h，棄培養基，PBS洗滌，用多聚甲醛固定20 min，加入0.1%的曲拉通破膜處理15 min，PBS洗凈殘留曲拉通，加入含有5%BSA的PBS封閉30 min，加入β-catenin抗體，放置于濕盒中4 ℃過夜，常溫復性30 min，PBS洗滌，避光條件下加入帶CY3標記的熒光二抗，孵育2 h，PBS洗滌后用DAPI染色10 min，PBS洗棄殘留DAPI，用抗熒光淬滅劑封片處理，熒光顯微鏡下拍照觀察。

2 結果

2.1 不同濃度五味子甲素對AsPc-1細胞增殖的影響結果比較 ①12.5 μmol/L組、25 μmol/L組、50 μmol/L組、100 μmol/L組、對照組細胞增殖率分別為95.3%±3.5%、73.2%±1.8%、56.6%±3.3%、41.4%±2.9%、100.0%±0.0%，其中12.5 μmol/L組與對照組相比，P>0.05；其余各組間相比，P均<0.05；提示五味子甲素對AsPc-1細胞增殖有抑制作用，且抑制效果呈濃度依賴性。②五味子甲素組、對照組的細胞克隆數分別為(410±30)、(180±20)個，兩組相比，P<0.05。

2.2 五味子甲素對AsPc-1細胞凋亡的影響結果比較 五味子甲素組、對照組的細胞凋亡率分別為16.36%±1.54%、4.58%±0.83%，兩組相比，P<0.05。

2.3 不同濃度五味子甲素對AsPc-1細胞β-catenin蛋白和凋亡相關蛋白Bcl2、Bax表達的影響結果比較 隨著五味子甲素濃度增加，Bcl2蛋白的相對表達量逐漸下調，而Bax蛋白的相對表達量逐漸增加，全長度β-catenin蛋白和78 kD的β-catenin蛋白的相對表達量也逐漸下調。見表1。

表1 各組細胞Bcl2、Bax、β-catenin蛋白相對表達量比較

注：與對照組相比，﹡P<0.05；與25 μmol/L組相比，﹟P<0.05；與50 μmol/L組相比，△P<0.05。

2.4 五味子甲素對AsPc-1細胞β-catenin蛋白核定位的影響結果比較 對照組β-catenin蛋白出現細胞核聚集現象，五味子甲素組β-catenin蛋白在細胞核的聚集明顯減少。

3 討論

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統腫瘤，患者預后極差，盡管手術治療、傳統化療藥物化療等不斷完善，但是胰腺癌的5年生存率仍沒有得到非常大的提高，同時由于化療藥物的大量使用，還存在著復發、耐藥、化療藥物造成心腎毒性等方面的問題。因此，繼續尋找有效的胰腺癌治療藥物有重要意義。

近年來，我國中藥提取物在治療腫瘤方面的潛在價值逐漸被重視。Nams 等[6]報道納米磁粒包裹的白蘆藜醇可以高效地被卵巢癌細胞SKOV3攝取且持續抑制其增殖能力；青藤堿可以通過抑制腫瘤細胞產生IL2、IL6、COX2等炎癥因子，抑制胃癌、肝癌以及結直腸癌等多種腫瘤[7]；蟲草素具有抑制骨肉瘤細胞增殖及誘導其凋亡的作用[8]。五味子是傳統中草藥之一，其提純的五味子甲素是值得注意的有效成分之一。Lee等[3]發現，五味子甲素可引起卵巢癌細胞周期阻滯從而抑制卵巢癌細胞的增殖，還可以通過抑制腫瘤相關巨噬細胞的活性，減少微環境中的炎性因子。然而，五味子甲素是否對胰腺癌也有作用，目前還沒有相關報道。在本研究中，我們發現五味子甲素可以抑制AsPc-1的細胞增殖和克隆形成，促進其凋亡，表明五味子甲素具有抑制胰腺癌細胞生長和促進其凋亡的潛在藥用價值。

為了進一步探討和驗證五味子甲素對腫瘤細胞的調控作用，實驗進一步檢測了凋亡相關的標志性蛋白Bcl2和Bax。Bcl2是抑制凋亡的重要因子，位于線粒體外膜上，可通過降低線粒體的通透性，降低細胞色素C的釋放，從而抑制細胞凋亡。Bax是促凋亡因子，一般位于細胞質中，當受到凋亡信號刺激時，會轉位到線粒體外膜上，導致Bax二聚體的形成增多，線粒體膜的通透性增加，細胞色素C釋放增多，細胞凋亡增加[9]。本研究發現，五味子甲素可以使AsPc-1細胞的Bcl2蛋白相對表達量下調，使Bax蛋白相對表達量上調，這種調控效應隨五味子甲素濃度的增加而增強，表明五味子甲素可以通過調控Bcl2和Bax蛋白表達促進細胞凋亡。

在細胞中，調控Bcl2和Bax表達是一個復雜的網絡體系[10,11]。β-catenin是其中重要的調控因素之一。為了解五味子甲素是否通過影響β-catenin及其78 kD水解片段的蛋白水平，從而參與調控Bcl2和Bax蛋白的表達，本研究對β-catenin蛋白及其水解片段進行檢測，結果發現五味子甲素可以使AsPc-1細胞中的β-catenin蛋白及其78 kD水解片段的表達顯著減少，而且78 kD水解片段減少更為顯著。免疫熒光檢測結果顯示，五味子甲素組AsPc-1細胞中β-catenin蛋白在細胞核的聚集現象也明顯減少。以上結果提示，五味子甲素可能通過影響β-catenin蛋白的表達和水解，減少其在細胞核內的定位，從而達到影響其轉錄因子活性的作用，進而抑制AsPc-1細胞的增殖，促進細胞凋亡。

綜上所述，五味子甲素可以抑制人胰腺癌細胞AsPc-1的增殖(呈濃度依賴性)、克隆形成能力，促進細胞凋亡；五味子甲素可能是通過降低β-catenin蛋白的表達和水解、減少其在細胞核內的定位發揮調控作用。