固相萃取-高效液相色譜測定飼料中新橙皮苷二氫查耳酮和柚皮苷二氫查耳酮

潘 城, 胡朝陽, 任小英, 吳 凌, 黃何何, 江鳳玲, 謝 勇, 邱秀玉

(福建省產品質量檢驗研究院, 福建 福州 350002)

二氫查耳酮衍生物具有甜度好、持續時間長、穩定性好等優點,在飼料工業中有著廣泛的應用[1,2]。其作為調味劑加入飼料中能產生持久的新鮮甜味效應,與其他甜味劑復配能起協同作用,可增進仔豬食欲,促進生長,改善母豬產后進食,縮短產后恢復時間。此外,由于其極佳的苦味掩蔽和增香作用,能大大改善飼料本身的風味和適口性,掩蓋飼料中添加藥物或甜味劑(如糖精、甜菊糖等)帶來的苦味[3,4]。歐盟法規(EU)2015/264[5]已批準新橙皮苷二氫查耳酮(NHDC)可作為調味劑加入魚、羊、狗、小牛和某些類別的豬飼料中,中國《飼料添加劑安全使用規范(2017年修訂版)》[6]允許其作為豬飼料甜味劑使用,上述法規規定最高限量均不得超過35 mg/kg。

目前,柚皮苷二氫查耳酮(Naringin DC)的檢測方法尚未見報道,新橙皮苷二氫查耳酮的測定方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[7-13]、高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法[14-21]、毛細管電泳法[22]、電化學傳感器法[23]等。HPLC-MS/MS法質譜儀器昂貴,檢測成本較高,難以普及應用;毛細管電泳法重現性較差、檢測靈敏度較低;電化學傳感器穩定性較差,儀器使用壽命較短,導致檢測成本提高;HPLC法具有定量準確可靠、檢測成本較低、普及范圍廣等優點,已經被廣泛應用于飼料行業檢測領域。當前,二氫查耳酮類物質的檢測方法報道多見于食品方面,飼料領域研究甚少,歐盟飼料添加劑檢驗標準實驗室(EURL-FA)[24]建立了飼料中新橙皮苷二氫查耳酮的測定方法,提出飼料樣品經超聲萃取后直接過濾上機檢測,定量限為0.8 mg/kg。該方法前處理過程較為簡單,但檢測限相對較高,而飼料基質成分復雜,企業出于成本考慮在生產過程中添加的二氫查耳酮含量往往低至1 mg/kg左右,因此需要更進一步的凈化手段以保證飼料中低含量二氫查耳酮的測定準確性。

本文建立了固相萃取結合HPLC法同時測定飼料中新橙皮苷二氫查耳酮和柚皮苷二氫查耳酮。該方法具有良好的抗干擾能力,檢測靈敏度高,重現性好,適用于飼料中二氫查耳酮的定量檢測,可為飼料生產企業、飼料監管部門和進出口檢測部門提供方法依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀配光電二極管陣列檢測器(美國安捷倫科技有限公司); DS-8510超聲波發生器(上海生析超聲儀器有限公司);分析天平(賽多利斯北京有限公司); Milli Q超純水制備器(美國密理博有限公司);旋轉蒸發器RE-5203(上海亞榮生化儀器廠); 60位全自動平行濃縮儀(美國瑞科有限公司);單發渦旋振蕩器(德國IKA有限公司); Sigma 4-16KS高速冷凍離心機(北京博勱行儀器有限公司)。WondaSep?HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,島津(上海)實驗器材有限公司); Clearnert PEP-2固相萃取柱(500 mg/6 mL,天津博納艾杰爾公司); C18固相萃取柱(200 mg/3 mL,福建藍昊生物科技有限公司); BRP固相萃取柱(60 mg/3 mL,月旭科技(上海)股份有限公司); ProElut NH2固相萃取柱(200 mg/3 mL,北京迪馬科技有限公司)。乙二胺基-N-丙基(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、佛洛里硅土填料(安捷倫科技有限公司); Spax GP-C18填料(40～60 μm,12 nm,美國賽分科技有限公司)。尼龍66有機濾膜(0.45 μm,天津津騰有限公司);甲醇(色譜純,山東禹王實業有限公司);其他試劑均為國產分析純。

標準品:新橙皮苷二氫查耳酮(純度98.0%)、柚皮苷二氫查耳酮(純度98.0%)均購于天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 溶液配制

標準儲備液的配制:準確稱取新橙皮苷二氫查耳酮和柚皮苷二氫查耳酮標準品(純度均為98.0%)各0.100 0 g,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制得質量濃度均為980 mg/L的標準儲備液。

標準工作溶液的配制:將新橙皮苷二氫查耳酮和柚皮苷二氫查耳酮的標準儲備液采用逐級稀釋法用50%(體積分數,下同)甲醇溶液配制濃度為0.2、0.5、1.0、5.0、9.8和49.0 mg/L的系列標準工作溶液。所有標準儲備液和標準工作溶液置于0～4 ℃下保存。

1.3 樣品預處理

稱取10.00 g飼料樣品于100 mL具塞錐形瓶中,加入70 mL甲醇溶液,置于超聲波振蕩器中超聲萃取30 min,轉移至100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度線并混勻。取40 mL溶液,以10 000 r/min的速度離心3 min,取10 mL上清液于50 mL雞心瓶中,在旋轉蒸發儀上于40 ℃下旋至近干,用2 mL 50%(體積分數,下同)甲醇溶液分兩次渦旋溶解后轉移至50 mL離心管中,加入8 mL純水,以10 000 r/min的速度離心3 min,待凈化。先后用3 mL甲醇和3 mL純水淋洗HLB小柱,將上述溶液轉移至HLB小柱,保持流出液流速為每分鐘1～2滴,待上柱液全部流出后,用5 mL 10%甲醇溶液淋洗,棄去淋洗液,用5 mL 60%甲醇溶液洗脫,將洗脫液氮吹至0.5 mL,加入50%甲醇溶液定容至1.0 mL,混勻,以尼龍66有機濾膜過濾,濾液供分析用。

圖 2 采用不同色譜柱和不同流動相時兩種二氫查耳酮的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the two dihydrochalcones using different chromatographic columns and mobile phases a. Waters Symmetry?C18 column with methanol/water as the mobile phases; b. CNW?Athena C18-WP column with methanol/water as the mobile phases; c. Welch ultimate?XB-C18column with methanol/water as the mobile phases; d. Welch ultimate?XB-C18 column with acetonitrile/water as the mobile phases. Peak Nos.: 1. Naringin DC; 2. NHDC.

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱:Welch ultimate?XB-C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:35 ℃;流動相:A相為甲醇,B相為純水;流速:1.0 mL/min;進樣量:25 μL;檢測波長:282 nm。梯度洗脫程序:0～15.0 min, 43%A; 15.0～15.5 min, 43%A～90%A; 15.5～20.0 min, 90%A; 20.0～20.5 min, 90%A～43%A; 20.5～25.0 min, 43%A。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇和優化

2.1.1檢測波長的選擇

為了考察檢測波長對目標化合物檢測靈敏度的影響,利用DAD檢測器在210～800 nm波長范圍內對標準溶液進行掃描,得到兩種二氫查耳酮的紫外-可見光譜圖(見圖1)。為消除溶液中有紫外吸收的雜質在低波長處的干擾,最終選擇282 nm作為檢測波長。

圖 1 兩種二氫查耳酮的紫外-可見光譜圖Fig. 1 UV-Vis spectra of the two dihydrochalconesNHDC: neohesperidin dihydrochalcone; Naringin DC: naringin dihydrochalcone.

2.1.2色譜柱和流動相的選擇

比較了Waters Symmetry?C18柱(150 mm×3.9 mm, 5 μm)、CNW?Athena C18-WP柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)和Welch ultimate?XB-C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)這3種分析柱以及不同流動相體系對兩種二氫查耳酮的分離效果。結果表明,當流動相體系為甲醇/水時,目標物在Waters Symmetry?C18柱上無法達到有效分離(見圖2a);在CNW?Athena C18-WP柱上達到基線分離,但出峰時間較晚、峰形展寬,容易受雜質峰干擾,影響定量檢測(見圖2b);而在Welch ultimate?XB-C18柱上可得到較理想的分離效果,兩種二氫查耳酮色譜峰的分離度好、靈敏度高,且出峰時間適宜(見圖2c);當流動相體系為乙腈/水時,其在Welch ultimate?XB-C18柱出峰太快且無法分離(見圖2d)。因此選用Welch ultimate?XB-C18柱作為分析柱,以甲醇/水為流動相進行梯度洗脫檢測。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1提取條件的優化

比較了純水、50%甲醇溶液和純甲醇溶液的超聲萃取效果。經加標回收試驗考察,超聲提取30 min,在50%甲醇溶液和純甲醇提取體系下,兩種二氫查耳酮的加標回收率均可達95%以上,而純水作為提取體系下的加標回收率均低于40%。飼料中往往含有飼料蛋白質,使用純甲醇溶液提取能夠較好地沉淀飼料蛋白質,同時便于進行后續的濃縮步驟,因此選擇純甲醇溶液作為提取溶劑。

2.2.2濃縮條件的優化

考察了濃縮過程對于兩種二氫查耳酮加標回收率的影響。向10 mL離心后的空白基質樣品提取液中加入1 mL 0.980 mg/L混合標準溶液,在旋轉蒸發儀上于40 ℃下旋至近干,用1 mL 50%甲醇溶液溶解,過濾后上機檢測。結果表明,經過濃縮,柚皮苷二氫查耳酮和新橙皮苷二氫查耳酮獲得理想的回收率,平均回收率分別為101%和104%。

2.2.3凈化條件的優化

QuEChERS法[25,26]和固相萃取法[27,28]已被廣泛應用于飼料的前處理凈化。考察了GCB、C18粉、PSA、佛洛里硅土等4種吸附劑對兩種二氫查耳酮回收率的影響及其凈化效果,其回收率分別為39%～48%、85%～97%、81%～97%和79%～90%。GCB的凈化效果良好但回收率低,C18、PSA和弗羅里硅土3種吸附劑的回收率較高但凈化效果不明顯,因此QuEChERS法不適用于本試驗中飼料樣品的前處理。

圖 3 兩種二氫查耳酮在不同固相萃取柱上的平均回收率(n=3)Fig. 3 Mean recoveries of the two dihydrochalcones ondifferent solid phase extraction columns (n=3)

考察了兩種二氫查耳酮在NH2、PEP-2、BRP、C18、HLB等5種固相萃取柱上的回收率,結果見圖3。由圖可知,NH2和PEP-2柱對兩種二氫查耳酮的保留效果較差,平均回收率分別為0.4%和17.0%; HLB、C18和BRP柱的平均回收率為92%～98%,兩種二氫查耳酮在HLB柱上的回收率最高,平均回收率均達98%。以HLB為凈化小柱,進一步比較了洗脫液甲醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、80%和100%的洗脫效果。結果表明,隨著洗脫液甲醇濃度的增加,兩種二氫查耳酮的回收率增大,50%甲醇溶液洗脫的回收率在78%左右,當甲醇體積分數增加到60%及以上時,回收率均在98%以上,同時能達到較理想的凈化效果,繼續增加甲醇體積分數會帶進更多雜質干擾,因此選擇60%甲醇作為洗脫液。同時進一步優化了洗脫體積,洗脫液為3 mL時回收率在90%左右,5 mL時回收率在98%左右。因此選擇5 mL的60%甲醇溶液進行洗脫。

圖 4 豬飼料和魚飼料經HLB固相萃取柱凈化的結果Fig. 4 Results of pig and fish feeds cleaned up usingan HLB solid phase extraction column

同時考察了HLB小柱對豬和魚飼料的凈化效果(見圖4和圖5)。結果表明,樣品經HLB小柱凈化后,豬和魚飼料基質干擾效應明顯降低,因此選用HLB小柱作為凈化柱。

圖 5 豬飼料和魚飼料加標樣品經HLB固相萃取柱凈化的結果Fig. 5 Results of spiked pig and fish feeds cleaned upusing an HLB solid phase extraction column Peak Nos.: 1. Naringin DC (1.0 mg/kg); 2. NHDC (1.0 mg/kg).

2.3 線性方程、線性關系、檢出限及定量限

配制兩種二氫查耳酮質量濃度為0.196到49.0 mg/L之間的系列混合標準工作溶液,以峰面積對質量濃度(單位mg/L)進行線性回歸,線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限見表1。結果表明,新橙皮苷二氫查耳酮和柚皮苷二氫查耳酮在0.2～49.0 mg/L內具有很好的線性關系,相關系數r均>0.999,定量限分別為0.02和0.01 mg/kg,方法定量限完全能滿足飼料中二氫查耳酮的檢測要求。

2.4 方法回收率和精密度

在優化后的檢測條件下,取飼料樣品進行加標回收率測試,加標水平分別為0.1、1.0、4.7和9.8 mg/kg,每個水平重復分析3次,結果見表2。從表2中可知,該方法的加標回收率范圍為86.2%～105.0%, RSDs為1.0%～6.3%。結果表明,該方法適用于飼料中兩種二氫查耳酮的日常分析檢測。

2.5 穩定性

取0.2、1.0和9.8 mg/L 3個質量濃度的二氫查耳酮標準溶液,于室溫下放置2、4、6、8、12 h和2～6 d,考察二氫查耳酮標準溶液的日內和日間穩定性。結果表明,低、中、高3個質量濃度的二氫查耳酮標準溶液日內精密度分別為2.7%～4.1%、0.7%～2.0%和0.1%～0.6%,日間精密度分別為3.2%～6.0%、3.1%～5.3%和0.9%～1.7%。由此可見,兩種二氫查耳酮日內和日間穩定性均較好,有利于實驗的進行。

2.6 實際樣品檢測

應用本方法分別對共計20件不同批次的飼料樣品進行測定,有一件檢測出新橙皮苷二氫查耳酮,含量為0.42 mg/kg。

表 1 兩種二氫查耳酮的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

表 2 飼料中兩種二氫查耳酮的加標回收率和相對標準偏差(n=3)

3 結論

本文采用固相萃取結合高效液相色譜法對飼料中二氫查耳酮含量進行分析檢測。該方法采用甲醇超聲萃取,經HLB小柱固相萃取凈化,較大程度降低了飼料復雜基質的干擾。方法靈敏度高,重現性好,適用于飼料中二氫查耳酮的定量檢測,可為飼料生產企業、飼料監督部門及進出口檢測部門提供技術支持。