加速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定茶葉中擬除蟲菊酯類農藥殘留

焦慧澤, 陸世清, 侯 迪, 張前前*

(1. 欽州海關國家燕窩及營養(yǎng)保健品監(jiān)測重點實驗室(欽州), 廣西 欽州 535000; 2. 中國海洋大學化學化工學院, 山東 青島 266100)

擬除蟲菊酯類農藥是一類人工合成的模擬天然除蟲菊素的新型殺蟲劑, 占全球殺蟲劑市場的20%左右[1],具有殺蟲譜廣、快速、高效等優(yōu)點,被廣泛應用于害蟲防治工作[2]。茶是我國的傳統(tǒng)飲品,但目前茶葉的生產中存在農藥濫用現(xiàn)象,其中擬除蟲菊酯類農藥濫用尤為嚴重[3]。擬除蟲菊酯類農藥的某些種類(如溴氰菊酯等)有致癌、致畸和致突變作用[4,5],因此建立茶葉中擬除蟲菊酯類農藥測定新方法具有重要意義。

目前,針對擬除蟲菊酯類農藥的測定方法主要有氣相色譜-電子俘獲檢測器(GC-ECD)[6-8]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[9,10]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)[11-13]、薄層色譜法[14]、高效液相色譜法(HPLC)[15,16]和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[17,18]等。相比較其他方法,LC-MS/MS具有不需要耗時長的程序升溫過程、不需要復雜的衍生化處理、假陽性率低、靈敏度高、準確度高等優(yōu)勢,符合當前檢測要求的快速、準確、高效原則。目前尚未見LC-MS/MS測定茶葉中氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯等多種擬除蟲菊酯類農藥的報道。

加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction, ASE)在萃取過程中對萃取溶劑加壓,使其在高于沸點溫度時仍可保持液態(tài),而液體的溶解能力遠大于氣體的溶解能力,同時提高的溫度也能有效降低目標物分子與基質間的作用力[19],因此該方法有有機溶劑用量少、快速、基質影響小、萃取效率高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點。本文將ASE與LC-MS/MS有機結合,優(yōu)化了萃取、凈化過程及色譜-質譜條件參數(shù),可快速、準確、高效地測定茶葉中擬除蟲菊酯類農藥殘留。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LCMS-8040超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀,配電噴霧離子源(ESI)(日本Shimadzu公司), APLE-2000加速溶劑萃取儀(北京吉天儀器有限公司), KQ-700DE超聲波清洗器(昆山舒美公司), JHD-12A全自動氮吹儀(上海極恒公司), HSC-12B水浴氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司), T18 digital Ultra-Turrax均質器和MS3 digital渦旋振蕩器(德國IKA公司),高速離心機(H1850,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司), Arium comfort Ⅰ超純水裝置(德國Sartorius)。

生物芐呋菊酯、氟胺氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氟氰戊菊酯標準品(100 mg/L)均購于北京壇墨質檢科技有限公司,GCB/NH2固相萃取柱(500 mg/500 mg, 6 mL,上海安譜實驗科技股份有限公司), Florisil固相萃取柱(1 g, 6 mL,上海安譜實驗科技股份有限公司),乙腈、甲醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、環(huán)己烷、二氯甲烷(色譜純,德國Merck公司),甲酸(色譜純,上海麥克林生化科技有限公司),氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純,廣東光華科技股份有限公司)在500 ℃馬弗爐中灼燒4 h后置于干燥器中冷卻至室溫備用,乙酸銨(分析純,廣東光華科技股份有限公司)。

1.2 樣品前處理

1.2.1ASE萃取

準確稱取5 g已粉碎的茶葉樣品(精確至0.01 g),上加速溶劑萃取儀,移入已加入2 g硅藻土的34 mL萃取池中,再覆蓋1 g硅藻土。萃取溫度80 ℃,萃取壓力10.34 MPa(1 500 psi),加熱5 min,以正己烷-丙酮(2∶1, v/v)為溶劑靜態(tài)萃取5 min,沖洗體積為60%萃取池體積,60 s氮氣吹掃,循環(huán)一次,萃取完成。收集提取液,于全自動氮吹儀中在40 ℃氮吹濃縮至小于3 mL,加入少量正己烷溶解壁上殘渣,待凈化。

1.2.2固相萃取凈化

取GCB/NH2+Florisil串聯(lián)柱,在GCB/NH2柱上方裝約1 cm高的無水硫酸鈉,并依次用5 mL正己烷-丙酮(9∶1, v/v)活化、5 mL正己烷平衡。將待凈化液移入活化后的小柱,用10 mL正己烷-丙酮(9∶1, v/v)溶液分兩次洗脫,收集洗脫液,置于40 ℃水浴中氮吹近干,用1 mL初始流動相溶解殘渣,過0.22 μm濾膜后待上機。

1.3 色譜、質譜條件

1.3.1液相色譜條件

色譜柱:Shim-pack GIST C18柱(50 mm×2.1 mm, 2 μm);流動相:A為5 mmol/L乙酸銨+0.1%(v/v)甲酸水;B為甲醇;梯度洗脫條件:0～2 min, 20%A; 2～3.5 min, 20%A～10%A; 3.5～7 min, 10%A; 7～8 min, 10%A～20%A; 8～10 min, 20%A。柱溫:40 ℃;流速:0.4 mL/min;進樣量:1 μL。

1.3.2質譜條件

離子源:ESI;掃描方式:正離子掃描;霧化氣流速:3 L/min;干燥氣流速:15 L/min; 去溶劑管溫度:250 ℃;加熱塊溫度:400 ℃;檢測器電壓:1.74 kV;噴嘴電壓:4.5 kV;碰撞室氣體壓力:230 kPa;檢測模式:MRM。其他質譜參數(shù)(母離子、子離子、Q1預偏置電壓、碰撞能量、Q3預偏置電壓)見表1。

表 1 10種擬除蟲菊酯類農藥的離子對及相關電壓參數(shù)

CE: collision energy; * quantitative ion.

2 結果和討論

2.1 色譜、質譜條件的優(yōu)化

考察了以甲醇-水和乙腈-水為流動相時,ESI源正、負模式下10種擬除蟲菊酯類農藥的響應,實驗表明,ESI+下10種農藥的響應明顯優(yōu)于ESI-,因此選用ESI+對目標物進行測定。

流動相組成對LC-MS/MS的檢測影響較大,在對流動相為甲醇-水和乙腈-水的一級質譜的解析中發(fā)現(xiàn),除生物芐呋菊酯、氟胺氰菊酯和甲氰菊酯有豐度較高的[M+H]+外,其余7種農藥的加和離子主要為[M+NH4]+和[M+Na]+,且[M+Na]+豐度最高,但以[M+Na]+為母離子時,無法得到穩(wěn)定且豐度較高的子離子,因此考慮在水相中添加乙酸銨和甲酸以增強[M+H]+和[M+NH4]+的豐度以用于定量分析。向水相中添加一定乙酸銨至5 mmol/L和甲酸(0.1%, v/v),發(fā)現(xiàn)在加入乙酸銨或甲酸后,相對應的[M+H]+以及[M+NH4]+的豐度均較未加入時有顯著提高,比較了有機相分別為甲醇和乙腈時的加和物離子信號響應,結果表明應用甲醇時的離子化效率優(yōu)于乙腈。比較了有機相為甲醇,水相分別為5 mmol/L乙酸銨、0.1%(v/v)甲酸、5 mmol/L乙酸銨-0.1%(v/v)甲酸、10 mmol/L乙酸銨-0.1%(v/v)甲酸時,各化合物加和離子的豐度以及信號響應,試驗得出水相為5 mmol/L乙酸銨-0.1%(v/v)甲酸時其離子化效率最高;同時優(yōu)化了該流動相條件下的梯度洗脫程序,優(yōu)化后的色譜條件見1.3.1節(jié)。

在優(yōu)化好的色譜條件下對質譜檢測的子離子、四極桿預偏置電壓、碰撞能量等進行優(yōu)化。選擇信號強度高、響應穩(wěn)定、質荷比較大的2個碎片離子作為子離子。在MRM模式下針對四極桿預偏置電壓和碰撞能量進行了優(yōu)化,試驗表明,Q1預偏置電壓、Q3預偏置電壓、CE分別在10～22 V、13～29 V、11～39 V范圍內,質譜對應的響應值最優(yōu)。最終優(yōu)化結果見表1,優(yōu)化條件下的色譜圖見圖1。

圖 1 加標綠茶中10種擬除蟲菊酯類農藥的提取離子流色譜圖(0.1 mg/kg)Fig. 1 Extracted ion current (EIC) chromatograms of the 10 pyrethroid pesticides spiked in green tea (0.1 mg/kg) 1. flucythrinate; 2. fenpropathrin; 3. cyfluthrin; 4. cyhalothrin; 5. deltamethrin; 6. fenvalerate; 7. tau-fluvalinate; 8. bioresmethrin; 9. permethrin; 10. bifenthrin. Bule peak: quantitative ion; red peak: qualitative ion.

2.2 提取方式的選擇

目前針對茶葉中農藥殘留提取的傳統(tǒng)方法主要有振蕩、超聲及勻漿等,與這些方法相比,ASE具有有機溶劑用量少、操作簡單、耗時短、效率高等特點。因未尋得含有全部10種農藥的陽性樣品,所以選取了一個含有聯(lián)苯菊酯的紅茶樣品及一個含有溴氰菊酯的綠茶樣品,比較了4種提取方式的檢測結果。振蕩提取條件[20]:稱取1 g已粉碎茶樣,加入5.0 mL乙腈后旋渦振蕩混合2 min,靜置10 min后再旋渦振蕩混合2 min,離心3 min(5 000 r/min),將殘渣重復提取一次。超聲提取條件[21]:稱取5 g已粉碎茶樣,加入20 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1, v/v)溶液,旋渦1 min,超聲20 min后離心10 min(5 000 r/min),將殘渣重復提取兩次。勻漿提取條件[22]:稱取2 g已粉碎茶樣,加入2 g氯化鈉和10 mL乙腈溶液,在高速組織搗碎機上以15 000 r/min均質提取1 min后離心5 min(4 000 r/min),將殘渣重復提取2次(ASE提取條件見1.2.1節(jié))。4種提取結果見圖2, 4種提取方法中勻漿及ASE的提取效率較高,而ASE相比較勻漿操作更簡便、耗時更短且可以多通道多樣品同時處理,更符合實際檢測需要,因此本試驗選用ASE提取。

圖 2 不同提取方式下陽性樣品中聯(lián)苯菊酯、溴氰菊酯的含量Fig. 2 Measured bifenthrin and deltamethrin contents in positive samples using different extraction methods

2.3 ASE萃取條件的優(yōu)化

2.3.1萃取溶劑的優(yōu)化

研究了不同體積比(4∶1, 2∶1, 1∶1, 1∶2, v/v)的正己烷-丙酮作萃取溶劑時10種農藥的回收率,發(fā)現(xiàn)萃取溶劑中丙酮含量增加時,回收率也相應有所增高,但當丙酮含量高于50%之后,萃取液中雜質含量較高,在濃縮后會有較多黏稠雜質堵塞SPE柱,導致洗脫溶劑難以通過小柱。而從表2中也可以看出,當體積比為2∶1時,回收率在81.7%～93.6%之間,與1∶1、1∶2時相差不大,同時萃取液中雜質含量較少,因此選擇正己烷-丙酮(2∶1, v/v)為萃取溶劑。

表 2 采用不同體積比正己烷-丙酮混合溶劑萃取時農藥的回收率(n=3)

2.3.2萃取時間及萃取溫度的優(yōu)化

以正己烷-丙酮(2∶1, v/v)為萃取溶劑,比較了不同萃取時間(5、10、15 min)和萃取溫度(60、80、100、120 ℃)下農藥的回收率。試驗中發(fā)現(xiàn),萃取時間對回收率無明顯影響,為保證檢測效率,選擇萃取時間為5 min;而萃取溫度大于80 ℃時,回收率再無明顯變化,因此在能滿足萃取效果的前提下,設定ASE萃取溫度為80 ℃。

2.4 固相萃取凈化

茶葉中含有大量的色素、多糖等干擾成分,GCB/NH2柱可有效吸附去除色素、有機酸及糖分,而Florisil柱可以強吸附含電負性雜原子的極性干擾物,因此本實驗采用GCB/NH2+Florisil串聯(lián)柱凈化。

GCB/NH2柱和Florisil柱均為正相填料的固相萃取小柱,因此正己烷等非極性溶劑洗脫效果較差,而加入二氯甲烷、丙酮等溶劑會增強其洗脫效果。取4份空白樣品待凈化樣液,各加入10種擬除蟲菊酯類標準物質75 ng,以10 mL溶劑分兩次洗脫,考察洗脫液分別為正己烷-二氯甲烷(9∶1, v/v)、正己烷-丙酮(9∶1, v/v)、正己烷-二氯甲烷(8∶2, v/v)、正己烷-丙酮(8∶2, v/v)時定容至1 mL的回收率,發(fā)現(xiàn)洗脫液為正己烷-丙酮(9∶1, v/v)、正己烷-丙酮(8∶2, v/v)時的回收率較好,而正己烷-丙酮(9∶1, v/v)洗脫液中殘留雜質量較少,因此選擇正己烷-丙酮(9∶1, v/v)溶液洗脫。

2.5 檢出限、定量限及線性范圍

以初始流動相配制了質量濃度分別為0.5、1、5、10、20、50、100、200、400和1 000 μg/L的系列標準溶液,按照1.3節(jié)中的色譜、質譜條件進行分析,以峰面積(Y)對質量濃度(X,μg/L)進行最小二乘法線性回歸分析,其中氯氟氰菊酯及氯菊酯因有同分異構體出現(xiàn)兩個峰,采用峰面積加和值為Y值,判斷各組分的線性范圍。回歸方程的方差分析結果表明,F>F0.05(1, 8),p在2.6×10-16～2.1×10-9之間,即各組分峰面積與質量濃度的線性相關關系顯著。具體各組分的線性范圍、回歸方程及相關系數(shù)列于表3,相關系數(shù)均在0.999 5以上。

本方法的檢出限(LOD)、定量限(LOQ)分別根據(jù)3倍、10倍信噪比(S/N)計算得出,并換算成樣品中的目標物含量見表3。10種擬除蟲菊酯類農藥的檢出限和定量限分別在0.5～5.0 μg/kg和1.6～16.6 μg/kg之間,遠低于歐盟、日本及我國規(guī)定的最大殘留限量要求,符合實際檢測需要。

表 3 10種擬除蟲菊酯類農藥的保留時間、線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.6 方法的回收率和精密度

選取了空白綠茶、紅茶、烏龍茶、普洱茶樣品作為基質,分別在定量限、0.4 mg/kg以及最高殘留限量(maximum residue limit, MRL)[23](無MRL的加入1 mg/kg)共3個水平進行添加回收試驗,每種樣品在每個水平重復測定7次,具體結果見表4。試驗測得回收率為68.7%～103.8%, RSD為0.8%～13.2%,符合農藥殘留檢測的要求。

表 4 10種擬除蟲菊酯類農藥在4種基質中3個加標水平下的回收率及相對標準偏差(n=7)

表 4 (續(xù))

圖 3 空白紅茶樣品和陽性紅茶樣品的多反應監(jiān)測色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of a blank black tea sample and a positive black tea sample

2.7 實際樣品測試

利用本文方法測定了從市場采集的共27份實際樣品。圖3為空白樣品和陽性樣品的MRM色譜圖,這一陽性樣品中聯(lián)苯菊酯的含量為2.76 μg/kg。在檢測中發(fā)現(xiàn),8份綠茶檢出聯(lián)苯菊酯、氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯和溴氰菊酯,5份紅茶檢出氯氟氰菊酯和聯(lián)苯菊酯,檢出率高達48%,說明茶葉中擬除蟲菊酯類農藥殘留問題需重視。

3 結論

本研究建立了ASE-UPLC-MS/MS測定茶葉中10種擬除蟲菊酯類農藥殘留的方法。與傳統(tǒng)方法相比,本方法減少了有機溶劑用量、縮短了檢測周期、提高了檢測準確性,方法的回收率、精密度滿足農藥殘留檢測需要,檢出限、定量限能滿足歐盟、美國、日本及我國的限量要求。本研究為茶葉中擬除蟲菊酯類農藥殘留的進出口檢驗、國內市場監(jiān)管提供了更為環(huán)保、快速、準確的檢測手段。