高效液相色譜-串聯質譜法同時測定貝類中22種農藥殘留

范廣宇, 唐 秀, 張云青, 孟祥龍, 梁振綱

(1. 連云港海關, 江蘇 連云港 222042; 2. 海南出入境檢驗檢疫局技術中心, 海南 海口 570311)

隨著現代化學工業的發展,大量的農藥被投入到農業生產中,為農作物的產量提高發揮了巨大作用。但是,農藥殘留污染也成為一個值得重視的問題。農藥不僅可能殘留于農產品中,同時也會進入環境水體中。國內外的一些研究[1-4]已經發現,多種除草劑和殺蟲劑在環境水體中均有檢出,如莠去津、西瑪津、撲草凈和毒死蜱等。這表明,在環境水體中除草劑和有機磷類殺蟲劑的殘留污染普遍存在,這些進入環境水體中的農藥會在水生動物體內殘留和富集。貝類一般捕食水體中的微小生物,極易富集海洋水體中殘留的農藥[5],最終通過食物鏈影響到人類的健康。同時,在近海養殖中,一些貝類養殖戶采用三唑磷等殺蟲劑作為清塘劑來殺死魚蝦、保護貝類種苗。海邊大量魚蝦死亡的報道時有發生[6]。因此,貝類中除草劑和有機磷類殺蟲劑等農藥殘留風險較高,需要建立準確快速的檢測方法監控這些農藥殘留風險。

目前,對于水產品中農藥殘留采用的前處理方法主要有固相萃取法[7,8]、凝膠滲透色譜法[9-11]和QuEChERS法[12-14]等,檢測方法主要有氣相色譜法[7,8,15]、氣相色譜-質譜法[10-12]、液相色譜-質譜法[9,13,14,16,17]等。貝類中農藥的檢測方法的報道主要集中在有機氯、多氯聯苯等,同時檢測貝類中除草劑和有機磷殺蟲劑的報道較少。QuEChERS法因為其快速、簡便、安全和成本低等而得名,近幾年廣泛應用到農藥、獸藥等污染物的檢測中[18]。本研究基于QuEChERS法和高效液相色譜-質譜,建立了一種同時檢測貝類中22種農藥殘留的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP 4500液相色譜-串聯質譜儀(美國AB SCIEX公司); Analyst工作站;XS 204分析天平(瑞士Mettler公司); A10 Milli-Q超純水機(美國Millipore公司); TDL-40B型離心機(上海安亭科學儀器廠); XW-80A型漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)。

西草凈(simetryn)、敵草凈(desmetryn)、撲滅通(prometon)、特丁通(terbumeton)、草凈津(cyanazine)、西瑪津(simazine)、環嗪酮(hexazinone)、莠滅凈(ametryn)、環丙津(cyprazine)、莠去津(atrazine)、吡唑草胺(metazachlor)、撲草凈(prometryn)、特丁凈(terbutryn)、撲滅津(propazine)、異丙凈(dipropetryn)、異戊乙凈(dimethametryn)、特丁津(terbuthylazine)農藥標準品(純度>97%)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,樂果(dimethoate)、三唑磷(triazophos)、對硫磷(parathion)、丙草胺(pretilachlor)、毒死蜱(chlorpyrifos)農藥標準品(100 mg/L)購自農業部環境保護科研監測所。N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化炭黑(GCB)(美國Agilent公司);甲醇和乙腈均為色譜純(德國Merck公司);氯化鈉、無水硫酸鎂、甲酸和乙酸為優級純(中國國藥試劑公司)。實驗用水為超純水。樣品購自本地市場。

1.2 標準溶液的制備

標準儲備液:分別準確稱取農藥標準品,用乙腈溶解、定容,配制成100 mg/L的標準儲備液,于-18 ℃儲存。混合標準溶液:分別吸取標準儲備液,用乙腈稀釋,配制成1 mg/L的混合標準溶液,于-18 ℃儲存。使用前用乙腈稀釋至所需濃度。

1.3 樣品處理方法

準確稱取10.0 g樣品于50 mL離心管中。加入10 mL含0.1%(v/v)甲酸的乙腈,渦旋混合30 s。加入1 g NaCl和4 g MgSO4,渦旋混合2 min。離心后取1 mL上清液,置于裝有50 mg PSA和20 mg GCB的試管中,渦旋混合1 min。以4 500 r/min離心10 min,取上清液過0.22 μm濾膜后,上機測定。

1.4 色譜條件

色譜柱:ACE UltraCore 2.5 Super C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm);柱溫:35 ℃;流速:0.4 mL/min;流動相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為甲醇。梯度洗脫程序:0～1 min, 10%B; 1～2 min, 10%B～40%B; 2～16 min, 40%B～95%B; 16～18 min, 95%B; 18～18.1 min, 95%B～10%B; 18.1～20 min, 10%B。進樣體積:5 μL。

1.5 質譜條件

離子源為電噴霧電離(ESI)源;多反應監測(MRM)、正離子模式;實驗中所用的氣體均為高純氮氣;碰撞氣(CAD)壓力為41.4 kPa;氣簾氣(CUR)壓力為207 kPa;霧化氣(GS1)壓力為414 kPa;輔助氣(GS2)壓力為379 kPa;電噴霧電壓(IS)為5.5 kV;去溶劑溫度(TEM)為650 ℃;入口電壓(EP)為10 V;碰撞室出口電壓(CXP)為10 V。22種農藥的保留時間、監測離子對、碰撞電壓(CE)和去簇電壓(DP)見表1。

表 1 22種農藥的保留時間、監測離子對、碰撞電壓和去簇電壓

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

配制22種農藥的標準溶液(0.1 mg/L),采用注射泵直接進樣的方式注入質譜儀。采用ESI+方式進行一級質譜分析,確定母離子[M+H]+,優化DP。對母離子進行二級質譜掃描,優化CE,選擇兩個相對豐度較高且穩定的特征碎片離子作為定量定性離子。優化后的質譜參數見表1。

2.2 色譜條件的優化

目標化合物分別屬于三嗪類、酰胺類除草劑和有機磷類殺蟲劑,化學結構差異較大,同時存在同分異構體,對于色譜分離條件要求較高。本實驗采用ACE UltraCore 2.5 SuperC18柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)對目標化合物進行分離,梯度洗脫。考察了甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液和甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動性時,目標化合物的分離效果和色譜峰形。結果表明,當采用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液時,色譜峰分離效果不好,多個物質同時段出峰;當采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液和甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液時,各物質分離度較好;但采用前者時各物質的峰高為后者的3倍,可能是因為流動相含有酸時更有利于[M+H]+形成。因此本研究最終選擇甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動相進行分離。

在優化的條件下,22種農藥的提取離子色譜圖見圖1。

圖 1 22種農藥的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 22 pesticides

2.3 提取劑的優化

提取方法參照QuEChERS法,分別研究了甲醇、乙腈、含0.1%(v/v)甲酸的乙腈和含0.1%(v/v)乙酸的乙腈作為提取劑時,各目標物的提取效果。甲醇作提取劑時上清液渾濁,添加回收率均低于70%;而采用乙腈提取時,回收率均可以達到70%～120%;含0.1%(v/v)甲酸的乙腈和含0.1%(v/v)乙酸的乙腈提取時,與乙腈提取的回收率相當;但含0.1%(v/v)甲酸的乙腈提取液的峰形更好。因此選擇含0.1%(v/v)甲酸的乙腈作為提取溶劑。

圖 2 經PSA和GCB凈化后22種農藥的回收率分布Fig. 2 Recovery distribution of the 22 pesticides cleaned up by primary secondary amine (PSA) and graphitized carbon black (GCB)

2.4 凈化材料的優化

QuEChERS法多采用PSA作為凈化材料,本實驗同時加入GCB,去除提取液的色素。分別對PSA和GCB的使用量進行了優化。在添加量為2 μg/kg時,分別比較使用不同用量的PSA對目標化合物回收率的影響,結果見圖2。不添加PSA凈化時,目標化合物回收率低于70%的偏多;而當使用量為50 mg以上時,所有化合物的回收率均在70%～120%之間。可能是PSA用量少時,存在的共萃取干擾物對目標化合物的響應產生了影響。單獨用PSA凈化后的水產品樣品溶液呈黃色,為除去色素,加入GCB,考察其對目標化合物回收率的影響。加入20 mg GCB凈化后,提取液變為基本無色透明的溶液,回收率也全部在70%～120%之間。同時發現,當GCB使用量超過30 mg后,多數農藥回收率均有降低趨勢。因此,選擇采用50 mg PSA和20 mg GCB共同凈化提取液。

表 2 22種農藥的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.5 基質效應考察

為了考察基質效應(matrix effects, ME)的影響,按照1.3節分別對文蛤、扇貝、赤貝和青蛤4種貝類樣品進行前處理,配制基質匹配標準溶液,同時采用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈配制相同系列濃度的標準溶液,分別繪制標準曲線。按照下述公式進行計算:ME=[(基質匹配校準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率)-1]×100%。|ME|<20%為弱基質效應,20%≤|ME|≤50%為中等基質效應,|ME|>50%為強基質效應[19]。弱基質效應可以忽略,而中等基質效應和強基質效應則需采取基質匹配校正曲線等方法消除。計算結果顯示,22種農藥在4種貝類樣品中的|ME|均小于20%,所以本研究中直接采用純溶劑標準曲線。

2.6 方法學評價

2.6.1線性關系、檢出限和定量限

在優化的條件下,配制22種農藥質量濃度為0.25、0.5、1、5、10、50和100 μg/L的系列混合標準溶液,以各農藥定量離子的峰面積(Y)為縱坐標、質量濃度(X, μg/L)為橫坐標繪制標準曲線,得到的線性回歸方程和相關系數(r2)見表2。22種農藥在各自的線性范圍內線性良好,相關系數均大于0.997。以信噪比S/N≥3確定檢出限(LOD),以S/N≥10確定方法的定量限(LOQ),結果見表2。

2.6.2精密度與回收率

采用空白文蛤樣品,分別在22種農藥的定量限、2倍定量限和10倍定量限3個水平下進行添加回收試驗。按照1.3節處理后,每個水平重復測定6次。方法的回收率和精密度結果見表3。3個添加水平下,22種農藥的平均回收率為65.2%～109.4%,相對標準偏差為1.3%～15.2%(n=6)。

表 3 22種農藥的回收率和精密度(n=6)

2.7 實際樣品的測定

將本方法應用于20批樣品(其中文蛤8批、扇貝6批、赤貝4批和青蛤2批)的檢測,其中16批次有不同程度的檢出(>LOD)。毒死蜱、莠去津、撲草凈、三唑磷和西瑪津的檢出率較高,分別為70%、65%、65%、25%和25%,含量范圍分別為0.5～13.7、0.1～3.7、0.3～11.0, 0.5～2.5和0.3～0.8 μg/kg。從結果可以看出,貝類中這些農藥殘留的風險較高。但最新的國家標準《食品中農藥最大殘留限量》[20]中還沒有對貝類中的這些農藥殘留制定限量要求,國際食品法典委員會(CAC)、歐盟和美國等組織、國家和地區也沒有相關的限量要求,僅日本根據一律標準按照0.01 mg/kg的限量要求。因而需要更加全面地研究來評估潛在的風險。

3 結論

本研究建立了高效液相色譜-三重四極桿質譜檢測貝類樣品中22種農藥殘留的分析方法。貝類樣品采用含0.1%(v/v)甲酸的乙腈提取,PSA和GCB凈化,然后采用高效液相色譜-三重四極桿質譜法檢測。將該方法應用于貝類樣品檢測,檢出多種農藥殘留。該方法樣品前處理簡單,分析速度快,精密度和靈敏度高,能夠同時測定水產品中22種農藥殘留,對于貝類中農藥殘留風險評估有良好的應用前景。