中空纖維膜液相微萃取-超高效液相色譜測定蒙藥毛勒日-達布斯-4湯中兩種生物堿

寶貴榮, 孟 和, 李優鑫, 包建民*

(1. 呼和浩特職業學院生物化學工程學院, 內蒙古 呼和浩特 010051; 2. 天津大學藥物科學與技術學院, 天津 300072; 3. 內蒙古大學化學化工學院, 內蒙古 呼和浩特 010021)

蒙藥毛勒日-達布斯-4湯是在蒙醫臨床中常用的傳統蒙藥制劑,是由光明鹽、訶子、蓽茇和干姜各125 g組成的散劑。毛勒日-達布斯-4湯制劑通常是淺棕黃色至棕黃色粉末,具有溫胃、消食、解毒的功效。臨床常用于治療消化不良、胃脹、藥物中毒和食物中毒等。蒙藥毛勒日-達布斯-4湯的主要活性成分為胡椒堿和蓽茇寧,準確測定這些活性成分有助于該蒙藥走向現代化。雖然已有報道[1,2]用HPLC方法測定蒙藥毛勒日-達布斯-4湯中胡椒堿的含量,但該方法靈敏度不高。特別是當這些活性物質處于復雜樣品基質中且又是痕量的時候,就需將分離、富集等樣品前處理技術與定量檢測技術(如液相色譜)結合起來,以增加檢測的靈敏度和準確度。因此,有必要開發更加廣泛應用的樣品前處理技術并同時測定胡椒堿和蓽茇寧的分析方法。

中空纖維膜液相微萃取(HF-LPME)技術是集采樣、萃取和濃縮于一體的樣品前處理方法。該技術具有微量、快速、環境友好、操作簡便、廉價等優勢,克服了傳統樣品前處理的諸多不足[3],廣泛應用于藥品、環境等領域微痕量成分的分析測定[4]。HF簡便易得,在分析領域應用廣泛。但是HF種類太多,材質、直徑大小、壁厚、空隙率等的不同都會影響最終的萃取效果。正是因為HF這種多樣性,到目前為止,尚無一家商業化的液相微萃取裝置可以采購。這種非商業化限制了該技術的廣泛應用。因此,搭建HF-LPME裝置成了該領域研究的熱點。本文介紹一種實驗室自制裝置,將移液槍的槍頭剪短后用環氧樹脂膠粘在HF和瓶蓋之間,制成半自動化的HF-LPME裝置,用于監測蒙藥毛勒日-達布斯-4湯時的樣品前處理,與UPLC聯用,測定蒙藥毛勒日-達布斯-4湯中胡椒堿和蓽茇寧的含量。同時考察了影響HF-LPME效率的參數,并優化了色譜條件。此方法操作簡便、靈敏度高,可顯著提高檢出限,為蒙藥毛勒日-達布斯-4湯中生物堿的分析提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters ACQUITY UPLC、ACQUITY Ultra Performance二極管陣列檢測器(PDA)、Milli-Q超純水裝置(美國Millipore公司), KQ-300VDE型數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司), AnkeTDL-5-A型離心機(上海安亭科學儀器廠)。偏氟乙烯HF1(簡稱PVDF1, i. d. 1.57 mm, o. d. 1.96 mm, 23%空隙率)和偏氟乙烯HF(簡稱PVDF, i. d. 1.60 mm, o. d. 2.02 mm, 54%空隙率)購于安徽百奧秘科生物醫藥研究院,聚丙烯HF(簡稱PPHF, i. d. 0.50 mm, o. d. 0.80 mm, 0.2 μm空隙率)購于天津工業大學。

蒙藥毛勒日-達布斯-4湯由內蒙古國際蒙醫院提供;胡椒堿(純度98.0%)購自北京恒元啟天化工技術研究院;蓽茇寧(純度99.0%)由內蒙古大學蒙藥化學研究所提供;甲醇和乙腈(均為色譜純)購自天津大學科威公司;其他試劑均購自天津北聯精細化學品開發公司。

1.2 溶液配制

標準溶液:分別準確稱取20 mg胡椒堿和10 mg蓽茇寧對照品,用無水甲醇溶解并定容至50 mL,得到胡椒堿和蓽茇寧的標準儲備液,于4 ℃冰箱避光保存。工作溶液由標準儲備液稀釋至所需濃度。

樣品制備:取蒙藥毛勒日-達布斯-4湯散劑,研細,過80目篩子,取0.40 g,用95%(體積分數)乙醇超聲(270 W, 45 kHz)提取40 min后冷卻,定容至25 mL,揺勻后轉至塑料離心管中,以4 000 r/min的速度離心15 min,吸取上清液,過濾膜。

1.3 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國Waters公司);柱溫為40 ℃;進樣量為2 μL;流動相為乙腈和水(45∶55, v/v);流速為0.18 mL/min;檢測波長為338 nm。

1.4 HF-LPME

自制的HF-LPME裝置見圖1。將HF剪成30 mm長,放入甲醇中超聲清洗,自然晾干。將HF的一端加熱封死,另一端連接在移液槍的槍頭外部。為了避免HF脫落,使用環氧樹脂膠粘在HF與槍頭之間,槍頭的另一端剪短后固定在樣品瓶蓋的中間部位,并用微量注射器注入25 μL正辛醇。取1.8 mL樣品溶液加入HPLC自動進樣瓶中,將含正辛醇的HF放入此小瓶。在室溫以173 r/min的速度振蕩萃取128 min。萃取完畢,用微量注射器抽回5 μL正辛醇,并放入干凈的HPLC自動進樣瓶中,在37 ℃用氮氣吹干。殘渣以300 μL的甲醇復溶后過濾,濾液和給體相用UPLC分析。

圖 1 HF-LPME裝置Fig. 1 Hollow fiber liquid phase micro-extraction(HF-LPME) device

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

對UPLC流動相的比例和流速進行考察,結果見表1。以分離度最佳為選擇標準,選擇流動相為乙腈和水(45∶55, v/v),流速為0.18 mL/min。

表 1 流動相體積比及流速對保留時間和分離度的影響

2.2 HF-LPME條件的優化

2.2.1HF的選擇

HF具有疏水性,并有一定的機械強度[5]。為得到更好的萃取效率,對3種HF(PVDF1、PVDF和PPHF)進行了篩選。結果(見圖2a)表明,空隙率>50%的PVDF萃取效率最高,因此本試驗選用PVDF做HF。

圖 2 HF-LPME條件的優化(n=5)Fig. 2 Optimization of HF-LPME conditions (n=5)a. selection of hollow fiber; b. selection of extraction solvent; c. selection of salt mass concentration; d. selection of extraction time. PVDF: polyvinylidence fluoride HF; PPHF: polypropylene HF.

2.2.2有機溶劑的選擇

HF-LPME中選擇合適的有機溶劑至關重要。有機溶劑不僅要與HF有良好的親和力,且需具有疏水性、低揮發性以及適當的黏度[6,7]。考察了正丁醇、正戊醇、正己醇、正己烷、正辛醇等有機溶劑對藥物萃取效率的影響,結果見圖2b。正辛醇的萃取效率最好,其次是正己烷,但正己烷易揮發。因此,選用正辛醇為萃取溶劑。

2.2.3離子強度的選擇

HF-LPME中有機溶劑和樣品溶液之間的分配系數受樣品基體的影響,樣品溶液中加入無機鹽可增強溶液的離子強度[8]。通過向樣品溶液中加入0～20 g/L的氯化鈉來考察離子強度對胡椒堿和蓽菝寧萃取效率的影響,結果見圖2c。結果表明,目標物的峰面積隨氯化鈉質量濃度的增加而增加,氯化鈉質量濃度為10 g/L時達到了最高值,隨后峰面積逐漸降低,因此選擇在樣品溶液中加入10 g/L的氯化鈉。

2.2.4萃取時間的選擇

HF-LPME是基于物質傳質速率和萃取分配平衡的過程。萃取達到平衡時,待測物的萃取效率最高[9,10],但萃取時間過長,有機溶劑揮發且溶解,影響萃取效率。本文考察了萃取時間對胡椒堿和蓽菝寧萃取效率的影響,結果見圖2d。隨著萃取時間的增加,萃取效率增加,萃取2 h時基本達到平衡。綜合考慮,選擇萃取時間為128 min。

2.3 方法學研究

在優化條件下,分析線性范圍、檢出限、重現性,計算加標回收率。配制不同質量濃度標準溶液,以標準溶液質量濃度(X, μg/L)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸。胡椒堿和蓽菝寧分別在100～8 500和8.3～5 000 μg/L范圍內線性關系良好,相關系數大于0.996 7。按照3倍信噪比和10倍信噪比確定化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結果見表2。胡椒堿和蓽菝寧的檢出限為2.2和2.5 μg/L,定量限為7.3和8.3 μg/L,日間精密度為5.8%和7.8%,日內精密度為2.6%和3.1%。分別取20、250和500 μg/L 3個水平的加標樣品溶液,在最佳HF-LPME萃取條件下平行測定5次,用外標法計算胡椒堿和蓽菝寧含量,實驗結果表明,該方法重現性良好。

表 2 線性范圍、相關系數(r2)、檢出限、定量限、富集倍數(EF)和標準偏差(n=5)

a. 500 μg/L aqueous solutions were measured every 2 h in a day (n=5); b. 500 μg/L aqueous solutions were measured once a day (keep away from light) (n=5).

圖 3 胡椒堿和蓽菝寧標準溶液和樣品溶液的UPLC譜圖Fig. 3 UPLC chromatograms of piperine and piperlonguminine standard solution and sample solution

將本方法與蒙藥毛勒日-達布斯-4湯中胡椒堿含量測定方法[1,2]相比較,結果表明,該方法的檢測限優于文獻報道的結果。

2.4 實際樣品分析

取3批樣品,按1.2節方法制備樣品溶液。在優化條件下,以外標法測定并計算樣品中胡椒堿和蓽茇寧的含量。蒙藥毛勒日-達布斯-4湯中胡椒堿和蓽菝寧的含量分別為(80±1.28) μg/L和(4.16±0.36) μg/L, RSD均小于6.6%(n=3)。標準溶液和樣品溶液的色譜圖見圖3。

3 結論

本文通過對色譜條件和液相微萃取條件的優化,建立了HF-LPME-UPLC聯用測定蒙藥勒日-達布斯-4湯中2種生物堿含量的方法。本方法操作簡便、靈敏度高、具有富集倍數高、重現性好等優點,可廣泛用于蒙藥中胡椒堿和蓽菝寧的同時測定。