超高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-三重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定保健食品中14種性激素類(lèi)藥物

饒雅琨, 李 卓, 張荻悅, 董曼曼, 衛(wèi)星華, 陳 冬, 張亞鋒

(西安市食品藥品檢驗(yàn)所, 陜西 西安 710054)

性激素類(lèi)藥物,包括天然性激素和具有類(lèi)似生物活性的半合成或全合成化合物,其結(jié)構(gòu)母核多為環(huán)戊烷多氫菲,根據(jù)作用可分為雌激素、孕激素和雄激素。雌激素可減輕絕經(jīng)期綜合征的癥狀,也可用于治療痤瘡及老年性骨質(zhì)疏松[1];有文獻(xiàn)[2]報(bào)道,雌激素對(duì)老年人具有增強(qiáng)記憶力的作用。孕激素在臨床上多用于避孕,可與雌激素合并用藥用于絕經(jīng)期后替代治療[3]。雄激素具有同化蛋白質(zhì)的作用,能促進(jìn)骨骼肌發(fā)育[4]和骨質(zhì)合成[5],以及治療男性性功能減退。隨著年齡的增長(zhǎng),性激素分泌水平降低,人體表現(xiàn)出代謝減慢、脂肪增加、記憶力和精力減退、植物神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、骨質(zhì)疏松、糖尿病高血脂等疾病加重的癥狀[6]。在臨床上,補(bǔ)充性激素類(lèi)藥物有嚴(yán)格的適應(yīng)證和禁忌證,擅自不合理地?cái)z入性激素,會(huì)引起內(nèi)分泌失調(diào)、新陳代謝紊亂，以及增加罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[7]。

近年來(lái),隨著保健品市場(chǎng)的迅速發(fā)展,出現(xiàn)了許多祛除斑痕、改善更年期癥狀、延緩衰老、增強(qiáng)體力的保健品。一些不法商販為了追求經(jīng)濟(jì)利益,非法添加性激素類(lèi)藥物,消費(fèi)者服用這些藥物會(huì)嚴(yán)重?cái)_亂機(jī)體正常代謝,危害身體健康,長(zhǎng)期服用甚至危及生命安全。因此,應(yīng)建立測(cè)定保健品中非法添加性激素類(lèi)藥物的方法。

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)保健食品中性激素類(lèi)藥物測(cè)定的報(bào)道較少,多為氣相色譜-質(zhì)譜法[8,9]和液相色譜-質(zhì)譜法[10-12],前者的樣品前處理需要衍生化[8,9],操作復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng);后者涉及的樣品種類(lèi)[10]或化合物種類(lèi)[11]較單一,且離子源均采用ESI源[10-12],未考慮離子化方式對(duì)化合物響應(yīng)的影響。本研究采用固相萃取方法處理樣品,以大氣壓化學(xué)電離(APCI)為離子化方式,建立了超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定保健食品中14種性激素類(lèi)藥物的方法,并檢測(cè)了部分市售保健食品。所建方法前處理步驟簡(jiǎn)單高效,穩(wěn)定性好,靈敏度高,適用性好,對(duì)保健食品中性激素類(lèi)藥物非法添加的判定提供了重要的參考價(jià)值,為監(jiān)督機(jī)構(gòu)及消費(fèi)者提供了技術(shù)依據(jù),也促進(jìn)保健食品市場(chǎng)的進(jìn)一步規(guī)范化。本研究采用APCI作為離子化方式,可對(duì)其他研究工作中測(cè)定結(jié)構(gòu)類(lèi)似化合物時(shí)離子源的選用給予一定參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Ultimate 3000-TSQ Quantiva型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司),配有APCI源和TraceFinder定量處理軟件;HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司); Milli2Q型超純水器(美國(guó)Millipore公司); MS105、ME204E型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

乙腈和甲醇(色譜純,德國(guó)Merck公司);氯化鈉(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); Oasis HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,美國(guó)Waters公司)。

圖 1 14種性激素類(lèi)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of 14 sexual hormones

對(duì)照品:己烯雌酚(diethylstilbestrol,純度99.9%)、醋酸氯地孕酮(chlormadinone acetate,純度100%)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate,純度99.2%)、炔諾酮(norethindrone,純度99.4%)、醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate,純度99.6%)、米非司酮(mifepristone,純度99.5%)、甲基睪丸酮(methyltestosterone,純度100%)、雌三醇(estriol,純度97.4%)、己酸羥孕酮(hydroxyprogesterone caproate,純度99.8%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲烯雌醇醋酸酯(melengestrol acetate,純度99.5%)、醋酸羥孕酮(hydroxyprogesterone acetate,純度99%)、孕酮(progesterone,純度99%)、睪丸酮(testosterone,純度99%)均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;甲炔諾酮(norgestrel,純度99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司,14種性激素類(lèi)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。用甲醇分別配制14種性激素類(lèi)藥物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱冷藏保存;分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,配制成質(zhì)量濃度約為0.01～100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1樣品前處理

樣品為片劑,需先研成細(xì)粉;樣品為膠囊,需先取其內(nèi)容物研成細(xì)粉.

稱(chēng)取處理過(guò)的樣品1.0 g(精確至0.000 1 g),置于50 mL離心管中,加入飽和氯化鈉溶液3 mL(液體樣品加入3 mL飽和氯化鈉溶液后,再加入0.5 g氯化鈉),渦旋5 min,加入3 mL乙腈,渦旋3 min,超聲提取20 min,于-18 ℃以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,取乙腈層(上層);于下層中再加入3 mL乙腈,同法處理,合并兩次提取得到的乙腈層,于45 ℃水浴氮?dú)獯蹈?用3 mL甲醇-水(30∶70, v/v)溶解殘?jiān)?待凈化。

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化HLB固相萃取柱,將處理好的樣品上樣后,依次用3 mL水、3 mL甲醇-水(40∶60, v/v)淋洗,再用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,于45 ℃水浴氮?dú)獯蹈?用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水(30∶70, v/v)溶液溶解并定容至1 mL,待測(cè)。

1.2.2色譜條件

色譜柱:Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:A為10 mmol/L乙酸銨水溶液,B為乙腈;流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～5 min, 25%B; 5～18 min, 25%B～60%B; 18～22 min, 60%B; 22～24 min, 60%B～90%B; 24～29 min, 90%B; 29～32 min, 90%B～25%B; 32～39 min, 25%B。進(jìn)樣體積:5 μL。

1.2.3質(zhì)譜條件

電離方式:APCI;掃描模式:正離子/負(fù)離子;檢測(cè)方式:選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式;電暈電流:4 μA(正模式)、10 μA(負(fù)模式);鞘氣流速:4.87 L/min;輔助氣流速:3.41 L/min;反吹氣流速:1.5 L/min;離子傳輸管溫度:350 ℃;蒸發(fā)溫度:300 ℃。

14種性激素類(lèi)藥物的保留時(shí)間及其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 14種性激素類(lèi)藥物的質(zhì)譜參數(shù)

APCI: atmospheric pressure chemical ionization; * quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 離子源的選擇

液相色譜-質(zhì)譜儀使用的離子源為大氣壓離子(API)源,根據(jù)離子化原理分為3種,電噴霧電離(ESI)源的原理是在流動(dòng)相添加劑的幫助下,化合物在溶液中形成帶電離子,進(jìn)入ESI源,在霧化氣和高溫蒸發(fā)作用下,帶電液滴逐步脫溶劑形成化合物的氣態(tài)離子,ESI源適用于極性化合物的分析,應(yīng)用范圍最廣[13]; APCI源是在電暈放電作用下,霧化氣氮?dú)夂蜌饣牧鲃?dòng)相溶劑發(fā)生反應(yīng),生成預(yù)反應(yīng)離子,預(yù)反應(yīng)離子與溶劑分子反應(yīng)生成反應(yīng)離子H3O+和OH-,反應(yīng)離子以質(zhì)子轉(zhuǎn)移的方式與化合物分子反應(yīng),形成離子,這一過(guò)程均在氣相狀態(tài)中完成,所以要求化合物易揮發(fā),熱穩(wěn)定,適合中低極性化合物的分析[14];大氣壓光電離(APPI)源是利用紫外燈或激光的照射使氣相中帶有共軛雙鍵的化合物選擇性電離,適合弱極性和非極性化合物的分析[15]。在食品藥品等檢測(cè)領(lǐng)域,ESI源應(yīng)用最為廣泛,其次為APCI源,其可作為ESI源的重要補(bǔ)充[14]。有研究[16]表明,相對(duì)APCI源,采用ESI源時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)更為顯著。國(guó)內(nèi)已有的性激素檢測(cè)類(lèi)研究多采用ESI作為離子化方式[10-12],鮮少有APCI源用于性激素類(lèi)藥物的檢測(cè)。

在對(duì)14種性激素類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),由于性激素類(lèi)藥物多具有含有稠環(huán)的甾體母核結(jié)構(gòu),符合APCI源適合中低極性小分子化合物的分析特性。有文獻(xiàn)[17,18]報(bào)道,采用APCI源測(cè)定雌激素和脫氫表雄酮時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)更小,離子化效率更高。本實(shí)驗(yàn)取1.1節(jié)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,分別用ESI源和APCI源進(jìn)行分析,檢出限以3倍S/N計(jì)算。結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中雌三醇、己烯雌酚、米非司酮在采用ESI源測(cè)定時(shí)的檢出限較低,甲烯雌醇醋酸酯在采用ESI源和APCI源測(cè)定時(shí)的檢出限相同,其余10種性激素類(lèi)藥物在采用APCI源測(cè)定時(shí)的檢出限較低。分析化合物結(jié)構(gòu)可知，米非司酮含有一個(gè)叔氨基,具有較強(qiáng)的親質(zhì)子能力;雌三醇和己烯雌酚均含有酚羥基,具有較強(qiáng)的去質(zhì)子能力,因此這三者采用ESI源測(cè)定時(shí)響應(yīng)更好。而其他大多數(shù)性激素類(lèi)藥物缺少類(lèi)似的極性基團(tuán),在采用ESI源測(cè)定時(shí)響應(yīng)較差。綜合考慮,選擇APCI源同時(shí)測(cè)定14種性激素類(lèi)藥物。各待測(cè)化合物選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖2。

圖 2 14種性激素類(lèi)藥物的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig. 2 Selected reaction monitoring (SRM) chromatograms of the 14 sexual hormones

2.2 凈化條件的優(yōu)化

圖 3 不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液對(duì)14種性激素類(lèi)藥物回收率的影響Fig. 3 Effect of different volume fractions of methanol aqueous solution on the recoveries of the 14 sexual hormones

圖 4 經(jīng)固相萃取柱凈化前、后空白加標(biāo)樣品的全掃描色譜圖Fig. 4 Full scan chromatograms of the blanks spiked samples before and after purification with HLB SPE cartridges

由于保健食品多以動(dòng)植物為原料,基質(zhì)較為復(fù)雜,在采用液相色譜-質(zhì)譜法分析時(shí),可能污染離子源,或?qū)衔餀z測(cè)產(chǎn)生干擾。因此需要對(duì)提取后的樣品進(jìn)行凈化。有研究[10]采用酸性氧化鋁固相萃取柱和C18固相萃取柱依次凈化樣品,過(guò)程較復(fù)雜,重現(xiàn)性不佳。陳才軍等[11]比較了NH2固相萃取柱、氧化鋁固相萃取柱和HLB固相萃取柱在測(cè)定雌激素時(shí)的凈化效果,HLB固相萃取柱明顯優(yōu)于前二者;徐英江等[19]證實(shí)HLB固相萃取柱對(duì)大部分含雌激素樣品的凈化效果和回收率優(yōu)于硅藻土-硅膠(SLH)固相萃取柱和Carb-NH2(石墨化炭黑-氨基串聯(lián))固相萃取柱。HLB固相萃取柱的吸附劑為N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物,是一種親水親脂平衡的全能型反相吸附材料,其pH值適用范圍寬為0～14[20],對(duì)極性和弱極性化合物均可保留,并且具有水可潤(rùn)濕性,柱床不容易干涸[21]。近年來(lái)HLB固相萃取柱越來(lái)越多的運(yùn)用于食品[22,23]、保健食品[20,24]、農(nóng)獸藥殘留[25,26]和環(huán)境監(jiān)測(cè)[27,28]的分析中。結(jié)合文獻(xiàn)[11,19],本實(shí)驗(yàn)采用HLB固相萃取柱作為凈化柱,將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋至適宜濃度,上樣,采用體積分?jǐn)?shù)為10%～100%的系列甲醇水溶液分別洗脫,收集洗脫液,按1.2.1節(jié)方法進(jìn)行處理,測(cè)定不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇作為洗脫液時(shí)性激素類(lèi)藥物的回收率,結(jié)果見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)表明,采用10%～40%(v/v)甲醇水溶液作為洗脫液時(shí),14種性激素類(lèi)藥物的回收率均為0,采用50%～100%(v/v)甲醇水溶液作為洗脫液時(shí),14種性激素類(lèi)藥物的回收率隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大逐漸增大。因此,選擇40%(v/v)甲醇水溶液作為淋洗液,100%(v/v)甲醇水溶液作為洗脫液,可在不影響待測(cè)化合物回收率的前提下,最大程度的去除提取液中的極性雜質(zhì),凈化基質(zhì)。

在空白樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2.1節(jié)描述處理,分別取凈化前和凈化后的樣品殘?jiān)?用乙腈-10 mmol/L乙酸銨水(30∶70, v/v)溶液溶解并定容至1 mL,對(duì)其進(jìn)行全掃描,得到總離子流色譜圖(見(jiàn)圖4)?？梢钥闯?凈化后,保留時(shí)間在3 min之前的極性較強(qiáng)的部分雜質(zhì)被去除,減少了對(duì)質(zhì)譜的污染,且背景噪聲降低,待測(cè)化合物的信噪比增強(qiáng)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限

取1.1節(jié)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo),以1/x2為權(quán)重回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(見(jiàn)表2)。結(jié)果表明,14種性激素類(lèi)藥物在各自的線(xiàn)性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.996。檢出限和定量限分別以3倍和10倍S/N計(jì)算,結(jié)果表明，檢出限為0.099 0～2.09 μg/kg,定量限為0.495～5.23 μg/kg(見(jiàn)表2)。

2.3.2回收率和精密度

在空白樣品中加入低、中、高3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2.1節(jié)樣品前處理方法,進(jìn)行加標(biāo)回收率的測(cè)定(n=6)。結(jié)果表明,保健食品中14種性激素類(lèi)藥品的平均加標(biāo)回收率為65.8%～118.8%, RSD均≤8.7%(見(jiàn)表3)。

2.3.3穩(wěn)定性

在空白樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2.1節(jié)方法進(jìn)行處理后,分別保存0、2、4、8、12和24 h,測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)14種性激素類(lèi)藥物的含量(見(jiàn)圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在24 h內(nèi),14種性激素類(lèi)藥物的穩(wěn)定性良好,其含量變化小于7.8%。

表 2 14種性激素類(lèi)藥物的線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 3 保健食品中14種性激素類(lèi)藥物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

圖 5 24 h內(nèi)14種性激素類(lèi)藥物的含量Fig. 5 Contents of the 14 sexual hormones within 24 h

2.4 樣品測(cè)定

按照建立方法對(duì)不同渠道購(gòu)買(mǎi)的不同品種多個(gè)批次保健食品(共計(jì)35批)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,2批樣品檢出睪酮11.7～21.0 μg/kg; 1批樣品檢出孕酮36.4 μg/kg,其余均未檢出。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-APCI-MS/MS)測(cè)定保健食品中14種性激素類(lèi)藥物的方法。方法靈敏度高,前處理較簡(jiǎn)便,回收率良好,適合固體類(lèi)保健食品和液體類(lèi)保健食品中性激素類(lèi)藥物的檢測(cè),同時(shí)也為其他樣品中性激素類(lèi)藥物檢測(cè)方法的建立提供參考。