基于DNA分子標(biāo)記的植物功能基因的分離策略

摘要：

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)正變得越來(lái)越廣泛，特別是在農(nóng)藝領(lǐng)域，植物功能基因的分離大量的應(yīng)用了該技術(shù)。未來(lái)的研究將探索分子標(biāo)記技術(shù)的新應(yīng)用，并使分子標(biāo)記技術(shù)更加全面。基因是產(chǎn)生特定蛋白質(zhì)的DNA序列，功能基因的分離有重要意義，本文綜述了植物種群的分離，DNA文庫(kù)的構(gòu)建，基因庫(kù)的構(gòu)建，靶基因的分離和鑒定，以及基于DNA分子標(biāo)記的植物功能基因的分離。

關(guān)鍵詞：

分子標(biāo)記；植物功能基因；基因分離

中圖分類號(hào)：Q7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：1019754/jnyyjs20190315012

前言

分離基因主要有正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)途徑2種不同的途徑。其中正向遺傳學(xué)就是依靠目的基因本身所具備的功能鑒定基礎(chǔ)之上對(duì)產(chǎn)物或者是某種表型突變來(lái)進(jìn)行鑒定；后者通過(guò)基因組中的特定序列或位置集中于基因本身。傳統(tǒng)的功能性克隆是基于已知基因的產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)其核苷酸序列，然后基于該序列設(shè)計(jì)探針或引物以篩選來(lái)自eDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的克隆，屬于前一類[1]。而先找到與靶基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記，然后通過(guò)“行走”或“著陸”染色體克隆靶基因的方式屬于反向遺傳學(xué)即第2類。

1DNA分子標(biāo)記在植物上的應(yīng)用

有許多具有獨(dú)特用途的分子標(biāo)記，并且已經(jīng)提出了植物中分子標(biāo)記組合的實(shí)例。而分析標(biāo)記概念從狹義角度上來(lái)講就是DNA標(biāo)記，可以對(duì)生物體或者是群體基因組中的一些差異DNA片段進(jìn)行反應(yīng)，分子標(biāo)記概念能夠很好的對(duì)基因組DNA之間的差異進(jìn)行反應(yīng)，其中一些非常常用的分子標(biāo)記有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。其中的EST是在mRNA的基礎(chǔ)之上的分子標(biāo)記。具體如下所示。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)與分子生物學(xué)的發(fā)展密切相關(guān)。由于DNA核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和DNA重組技術(shù)，基因定位突變，聚合酶鏈反應(yīng)，DNA限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Ran2），建立隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）和蛋白質(zhì)工程，以制定分子生物學(xué)研究成果遺傳學(xué)的理論研究和生物技術(shù)實(shí)際應(yīng)用的各個(gè)方面正發(fā)揮著巨大的作用[3]。

2植物功能基因的分離策略

植物基因組DNA育種的特殊遺傳群體是篩選與靶基因密切相關(guān)的分子標(biāo)記的關(guān)鍵步驟。靶基因必須滿足一些基本的條件：除了其所在基因組的局部區(qū)域外，基因組DNA序列的其余部分是相同的，并且在這些材料之間發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性標(biāo)記可以與靶基因緊密連鎖。靶基因的近等基因系（NIL）是一組合格的物種，鑒于NIL的遺傳組成，可能在近等基因系之間顯示多態(tài)性的分子標(biāo)記可能位于靶基因的2個(gè)翼附近。

21植物基因組DNA的提取方法

植物功能基因的提取是在基因?qū)用娴牟僮鳎F(xiàn)已在一定程度上有了較為成熟的方法，基因組DNA的提取是DNA分子標(biāo)記的前提，只有將基因組的DNA提取出來(lái)了，才能對(duì)DNA分子進(jìn)一步進(jìn)行標(biāo)記操作，才能使功能基因得到分離。在植物基因組DNA的提取技術(shù)上，科研工作者也做出了較多的努力，取得了較多的成果，較為成熟的方法也形成了一定的體系[4]。常見(jiàn)的DNA提取方法有：sDs法口；改良的SDS法；常規(guī)的CTAB法；高鹽CTAB法；改良的CTAB法。

22 DNA分子標(biāo)記方法

DNA分子標(biāo)記是指通過(guò)DNA分子水平的技術(shù)和方法鑒定生物體之間的不同DNA片段作為遺傳標(biāo)記。其中可以將DNA分子按照標(biāo)記方法的不同分為基于分子雜交的多態(tài)性比如說(shuō)RFLP（Re—strietion Fragment Lensth Polymorphism），以及基于PCR反應(yīng)的多態(tài)性如RAPD、SSR、AFLP、AP—PCR、DAF等共有2種標(biāo)記類型。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，其中DNA聚合酶使用2個(gè)寡核苷酸作為引物來(lái)催化位于2個(gè)引物中的DNA片段的擴(kuò)增。DNA分子標(biāo)記技術(shù)本身是一種非常有效的手段在基因定位中應(yīng)用非常廣泛，而且在新階段的基因分離和品種改良研究分析過(guò)程中也會(huì)起到一定的作用。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random Amplifi，edPolymorphic DNA，RAPD）是由Wil—liams（1990年）和Welsh（1990年）各自獨(dú)立提出的一種DNA多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)[5]。大量研究表明，SSR分子標(biāo)記具有簡(jiǎn)單，穩(wěn)定和良好的多態(tài)性。使用SSR標(biāo)記的前提是理解重復(fù)序列側(cè)翼的DNA序列，這使得該技術(shù)在應(yīng)用上受到限制，但近年來(lái)這一進(jìn)展迅速。

DNA分子標(biāo)記的方式，主要包含了以下一些基本的操作：分離大片段陽(yáng)性克隆的左端和右端，之后需要將其作為探針對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行再次的篩選，所獲得的新克隆則是沿著染色體的一種進(jìn)步和發(fā)展。在染色體行走過(guò)程中所需要面臨的主要問(wèn)題就是一旦需要對(duì)一些無(wú)法克隆的片段進(jìn)行傳遞時(shí)，就會(huì)使得步行過(guò)程出現(xiàn)中斷現(xiàn)象。但在不斷的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)染色體跳躍和連接等方法解決以上問(wèn)題。而跳躍文庫(kù)和連接庫(kù)的構(gòu)建主要由具有少量識(shí)別位點(diǎn)和大量識(shí)別位點(diǎn)2種不同的酶來(lái)完成的。其中skip文庫(kù)的插入物是從同一文庫(kù)中大片段克隆的雙消化部分。一些具備的切割點(diǎn)的酶產(chǎn)生了連接文庫(kù)的插入物，這些擦入物具備酶識(shí)別位點(diǎn)并且切割點(diǎn)較少。為能夠進(jìn)一步向靶基因靠近，可以將染色體步移中的跳躍以及結(jié)扎過(guò)程由2個(gè)文庫(kù)交替來(lái)完成。

3結(jié)束語(yǔ)

現(xiàn)科學(xué)研究中已經(jīng)利用DNA分子編輯實(shí)現(xiàn)了大量的植物功能基因的分離，隨著科技研究的發(fā)展，隨著各個(gè)領(lǐng)域的分子學(xué)水平的提高，該技術(shù)在基因分離上展示出了巨大的潛力和光明的前景。但是，中國(guó)與國(guó)際領(lǐng)先水平之間仍存在較大差距。推廣其應(yīng)用，利用先進(jìn)的科技水平為人類的生活水平的提高帶來(lái)益處。[JP]

參考文獻(xiàn)

[1]

華麗霞，何煉，蔣秋平，等.稻瘟病抗性基因特異性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用進(jìn)展[J].分子植物育種，2016，14（10）：2739-2748.

[2] 明金玉，李化丹，梁士博，等.植物功能性靶向基因標(biāo)記的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2017，37（3）：83-91.

[3] 瞿印權(quán)，徐雯，何天友，等.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在竹亞科植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（34）：45-47.

[4] 馮尚國(guó)，朱宇佳，焦凱麗，等.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在酸漿屬藥用植物中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)中藥雜志，2018（4）：672-675.

[5] 劉立敏，韓多，李海峰，等.HPLC含量測(cè)定和DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)重樓屬藥用植物的鑒定[J].遼寧中醫(yī)雜志，2017（2）：355-359.

作者簡(jiǎn)介：

程曼（1987-），女，中級(jí)職稱，山東，碩士研究生，研究方向：花卉組培及基因編輯。