天麻舒心方對自發性高血壓大鼠血壓及腸系膜三級動脈組織ACE、ACE2、Mas的mRNA及蛋白表達的影響

劉坤 徐貴成 尹倚艱

[摘要] 目的 觀察天麻舒心方對自發性高血壓大鼠（SHR）血壓及腸系膜三級動脈組織血管緊張素轉換酶（ACE）、ACE2及Mas的mRNA及蛋白表達的影響，探討SHR阻力血管富營養重塑及天麻舒心方的干預機制。 方法 80只SHR按照隨機數字表法分為中藥高、中、低劑量組，西藥對照組，模型對照組，每組各16只，分別予天麻舒心浸膏液高劑量[11.592 g/（kg·d）]、中劑量[5.796 g/（kg·d）]、低劑量[2.898 g/（kg·d）]、氯沙坦鉀混懸液、蒸餾水，15只Wistar大鼠作為正常對照。每2周測量1次鼠尾動脈血壓。18周后處死動物，分離腸系膜三級動脈，采用Western blot和RT-PCR檢測各組ACE、ACE2及Mas的蛋白和mRNA表達。 結果 給藥2周后，各給藥組血壓均顯著低于模型對照組（P < 0.01）。相對于正常對照組，模型對照組ACE mRNA及蛋白表達顯著增加（P < 0.05或P < 0.01），ACE2 mRNA及Mas mRNA含量及蛋白表達顯著減少（P < 0.05或P < 0.01）。與模型對照組比較，中藥高劑量組ACE mRNA表達降低（P < 0.05），Mas mRNA表達增加（P < 0.05），ACE2、Mas蛋白表達增加（P < 0.01）;中藥中劑量組ACE mRNA和蛋白表達均降低（P < 0.05），ACE2 mRNA表達增加（P < 0.05），Mas蛋白表達增加（P < 0.01）;中藥低劑量組ACE mRNA表達降低（P < 0.05），Mas mRNA和蛋白表達增加（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 天麻舒心方對SHR血壓具有較好控制作用。ACE合成增多，ACE2及Mas合成減少可能是高血壓阻力血管富營養重塑病理機制之一。平肝活血中藥可逆轉ACE、ACE2比例失衡，增加Mas表達，通過ACE2/Ang-（1-7）/Mas通路的干預，逆轉RAS失衡，改善高血壓阻力血管富營養重塑，減輕靶器官損害。

[關鍵詞] 天麻舒心方;高血壓;血管緊張素;阻力血管

[中圖分類號] R544.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（c）-0004-05

Effect of Tianma Shuxin Granules on the blood pressure and the mRNA and protein expression of ACE， ACE2 and Mas in the spontaneous hypertensive rats′ third-order branches of mesenteric arteries

LIU Kun XU Guicheng YIN Yijian PAN Limin WANG Yang

Department of General Internal， Guang′anmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Tianma Shuxin Granules （TSG） to spontaneous hypertensive rats （SHRs） on the blood pressure （BP）， as well as the mRNA and protein expression of angiotensin-converting enzyme （ACE）， ACE2 and Mas in the third-order branches of mesenteric arteries， and investigate the possible mechanisms of SHRs′ resistance vascular eutrophic remodeling and the intervention of TSG. Methods Eighty male SPF SHRs were divided into five groups with 16 rats in each group according to the random number table method： high dosage traditional Chinese medicine group [11.592 g/（kg·d） TSG]， medium dosage traditional Chinese medicine group [5.796 g/（kg·d） TSG] and low dosage traditional Chinese medicine group [2.898 g/（kg·d） TSG]， Western medicine control group and model control group were treated with TSG， Losartan Potassium Suspension and distilled water respectively. Fifteen Wistar rats were taken as normal control group. The BP of rat tail artery was measured fortnightly. After 18 weeks， rats in each group were killed and the mesenteric arteries were separated. The protein and mRNA expression of ACE， ACE2 and Mas were measured by Western blot and RT-PCR respectively. Results After 2 weeks of administration， the BP of the Western medicine control group， the high dosage traditional Chinese medicine group and the middle dosage traditional Chinese medicine group were significantly lower than that of the model control group （P < 0.01）. Compared with the normal control group， the mRNA and protein expression of ACE in the model control group were increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， and the content and the protein expression of mRNA of ACE2 and Mas were decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the model control group， the mRNA expression of ACE in the high dosage traditional Chinese medicine group was decreased （P < 0.05）， the mRNA expression of Mas was increased （P < 0.05）， the protein expression of ACE2 and Mas were increased （P < 0.01）. The mRNA and protein expression of ACE were decreased （P < 0.05）， the mRNA expression of ACE2 and the protein expression of Mas were increased in the medium dosage traditional Chinese medicine group （P < 0.05 or P < 0.01）. The mRNA expression of ACE was decreased （P < 0.05）， the mRNA and protein expression of Mas were increased in the low dosage traditional Chinese medicine group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion TSG has markedly effect in lowering SHRs′ BP. Increased synthesis of ACE， and decreased synthesis of ACE2 and Mas may be one of the pathological mechanisms of vascular nutrition-rich remodeling in hypertension resistance. TSG can reverse the imbalance of ACE and ACE2， increase the expression of Mas， it can reverse the imbalance of RAS by means of interfering the ACE2 - Ang （1-7） - Mas pathways， it is beneficial to improve the vascular hypertension resistance eutrophic remodeling and reduce the target-organ damage.

[Key words] Tianma Shuxin Granules; Hypertension; Angiotensin; Resistance vessel

高血壓是危害人類健康的重要疾病，早期累及小動脈，隨病情進展可遷延至大動脈。其發病機制復雜，腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）是關鍵環節[1-2]，在維持血壓及心血管微環境穩定中占據重要地位[3]。血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）增加，血管緊張素（angiotensinⅡ，AngⅡ）升高并與血管緊張素Ⅱ1型受體（angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R）相結合，RAS激活，導致血壓升高、心血管重塑和靶器官損傷[4]。ACE2可剪切AngⅠ轉化為Ang-（1-9），進一步在ACE的作用下轉化為Ang-（1-7）[5]，另可高效水解AngⅡ直接轉化為Ang-（1-7），Ang-（1-7）通過激活其受體Mas，發揮舒張血管作用，由此推斷，ACE2/Ang-（1-7）/Mas可能在平衡ACE/AngⅡ/AT1R的縮血管作用方面發揮關鍵作用[6]。前期研究顯示天麻舒心方在降壓同時具有改善阻力血管富營養重塑作用[7-8]。本研究以阻力血管腸系膜三級動脈為切入點，采用自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）模型，觀察天麻舒心方降壓作用并探討其可能機制，為天麻舒心方臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 實驗動物 SHR 80只，Wistar大鼠15只，雄性，鼠齡14周，動物級別：SPF級，許可證號：SCXK（京）2012-0001。均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，購置后于中國中醫科學院廣安門醫院動物中心飼養，該中心環境設施符合二級動物（清潔動物CL）標準。

1.1.2 實驗藥物 天麻舒心浸膏液（方由天麻、牛膝、牡蠣、赤芍、防己、玄參、水蛭、澤瀉組成），中國中醫科學院廣安門醫院制劑室生產。氯沙坦鉀（科素亞），杭州默沙東制藥有限公司生產（生產批號：H20030654），研碎，無菌蒸餾水溶解，制成2 mg/mL溶液。

1.1.3 主要試劑 單克隆小鼠抗大鼠ACE抗體（Millipore，Cat No：MAB3502-1），單克隆兔抗大鼠ACE2抗體（Abcam，Cat No：ab108252），單克隆兔抗大鼠MAS1抗體（Santa Cruz，Cat No：sc-135063）

1.1.4 主要儀器 動物無創血壓測量系統（成都泰盟科技有限公司BP-6），PCR儀（Long Gene MyGene MG96+），熒光定量PCR儀（Line-Gene K），凝膠成像系統（Gel Ocumentuteon Systern Beosens SC 805），低溫冷凍離心機（Thermo Fresco21），酶標儀（Thermo Multiskan MK3），電泳槽（Cavoy Mini P-4），濕轉電泳槽（Tanon VE186），電泳儀（北京六一 DYY-7C）。

1.2 給藥方法

80只SHR依據隨機數字表法分為中藥高、中、低劑量組，西藥對照組，模型對照組，每組各16只。中藥高、中、低劑量組分別予天麻舒心浸膏液11.592、5.796、2.898 g/（kg·d），相當于成人用生藥量[0.414 g/（kg·d）]的28、14、7倍;西藥對照組給予氯沙坦鉀混懸液17.5 mg/（kg·d）;模型對照組給予同體積蒸餾水。15只Wistar大鼠作為正常對照組給予同體積蒸餾水。灌胃給藥，每日1次。共18周。

1.3 鼠尾動脈壓測量

采用動物無創血壓測量箱。大鼠于箱內預熱15 min，待尾動脈充分擴張后將鼠尾套入尾袖中，動物安靜后充氣，待圖像平穩后勻速放氣，重復3次，取平均值，測定大鼠清醒安靜狀態下尾動脈的收縮壓。實驗開始及之后每2周測量1次。

1.4 RT-PCR法檢測腸系膜三級動脈組織ACE、ACE2及Mas的mRNA水平

給藥18周后，處死動物并留取腸系膜三級動脈標本并保存于-80℃冰箱。取-80℃冰箱保存的大鼠腸系膜三級動脈組織100 mg，Trizol一步法提取總RNA，比色法測定總RNA濃度和純度，逆轉錄反應后進行PCR擴增各基因PCR，擴增引物序列見表1。凝膠成像系統檢測各組mRNA表達強度。

1.5 Western blot法檢測腸系膜三級動脈組織ACE、ACE2和Mas蛋白表達水平

取材方法同前。取-80℃冰箱保存的腸系膜三級動脈組織提取蛋白，以BCA法測蛋白濃度，經聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳后，轉移到PVDF膜上，封閉液封閉。用5% BSA-TBST稀釋一抗，室溫孵育1 h，放4℃過夜。洗膜。二抗孵育。ECL加到膜上后反應3～5 min，膠片曝光：10 s～5 min（曝光時間隨不同光強度而調整），顯影2 min，定影。凝膠圖像分析系統照相和條帶密度掃描，按相對系數=目的帶表達強度/β-actin表達強度，計算目的蛋白表達相對水平。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 天麻舒心方對SHR血壓動態變化的影響

實驗過程中，中藥高、中、低劑量組，西藥對照組，模型對照組，正常對照組分別死亡4、1、2、3、1、1只大鼠，死亡原因為血壓測量時掙扎脫水、灌胃不慎藥物進入氣管窒息、同籠動物打斗致死等。

給藥前，模型對照組血壓水平高于正常對照組（P < 0.01），說明高血壓模型確立。無藥物干預下，SHR血壓水平隨鼠齡增加呈上升趨勢。給藥2周后，西藥對照組、中藥高劑量組、中藥中劑量組血壓均顯著低于模型對照組（P < 0.01），給藥14周后，各中藥組及西藥對照組血壓均顯著低于模型對照組（P < 0.01），見表2。

2.2 天麻舒心方對自發性高血壓大鼠腸系膜三級動脈組織中ACE、ACE2及Mas的蛋白表達及mRNA水平的影響

與正常對照組比較，模型對照組ACE的蛋白表達顯著增加（P < 0.01），ACE2及Mas蛋白表達顯著減少（P < 0.05或P < 0.01）。與模型對照組比較，中藥高劑量組ACE2、Mas蛋白表達增加（P < 0.01）;中藥中劑量組ACE 蛋白表達降低（P < 0.05），ACE2的Mas蛋白表達增加（P < 0.01）;中藥低劑量組Mas的蛋白表達增加（P < 0.01）。見圖1，表3。

與正常對照組比較，模型對照組ACE mRNA含量顯著增加（P < 0.05），ACE2及Mas的mRNA含量顯著減少（P < 0.05或P < 0.01）。與模型對照組比較，中藥高劑量組ACE mRNA含量降低（P < 0.05），Mas mRNA含量增加（P < 0.05）;中藥中劑量組ACE mRNA含量降低（P < 0.05），ACE2 mRNA含量增加（P < 0.05）;中藥低劑量組ACE mRNA含量降低（P < 0.05），Mas mRNA含量增加（P < 0.05）。見表4。

3 討論

RAS存在兩條相互拮抗的通路，即ACE/AngⅡ/AT1R通路和ACE2/Ang（1-7）/Mas通路[9]，前者主要通過AngⅡ引起血管收縮、血壓升高、促進心肌細胞和血管平滑肌細胞增生等效應[10];后者作用與前者作用相反，Ang（1-7）可抑制AngⅡ誘導的平滑肌細胞的增殖和遷移[11]，降低Ⅳ型膠原、轉化生長因子（TGF）-β1、血管內皮生長因子等表達[12]。另有研究發現，ACE2及其產物Ang（1-7）可減少細胞增殖及炎性反應從而具有改善動脈硬化作用[13-14]。使用ACE抑制劑或AT1R拮抗劑可升高Ang-（1-7）水平并激活Mas受體改善血管重塑[15]、產生心腎保護作用[16]。以外源性Ang（1-7）干預高血壓射血分數保留心力衰竭大鼠模型，可上調ACE2及Mas受體的表達，但不影響ACE表達，提示Ang（1-7）與其特異性受體Mas受體結合而發揮心血管保護作用[17]。采用體外培養人腎小球內皮細胞發現，Ang（1-7）可通過Mas受體拮抗AngⅡ誘導的腎小球內皮細胞損傷及氧化應激[18]。采用股動脈血管損傷模型小鼠更進一步發現[19]，Mas敲除小鼠與野生型小鼠比較，股動脈新內膜形成、細胞增殖、MCP-1、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、超氧化物歧化酶水平均顯著增高，而阿齊沙坦治療可顯著改善。可見，RAS雙通路在高血壓及其靶器官損害的研究中具有重要意義。

高血壓導致的血管病變在其靶器官損害的前期發揮著重要作用[20]。本課題組既往研究顯示，SHR阻力血管出現了以管腔內徑、外徑減少，中膜厚度、中膜厚度/內半徑增加為特點的富營養重塑[8]。天麻舒心方干預后，SHR腸系膜三級動脈管徑增加，平滑肌細胞增生、內彈力層變形及膠原纖維增生得到一定的抑制，高血壓阻力血管富營養重塑在顯微形態及超微結構層面得到改善[7]，由此推測，天麻舒心方通過調節阻力血管局部ACE2/Ang-（1-7）/Mas及ACE/AngⅡ/AT1R軸，發揮改善高血壓阻力血管富營養重塑的作用。

本研究建立SHR模型，并以天麻舒心方進行干預，監測血壓，并觀察阻力血管腸系膜三級動脈的RAS雙通路變化。結果發現，高血壓阻力血管局部出現RAS失衡，主要表現為ACE合成增多、ACE2及Mas合成減少，天麻舒心方除有效降壓外，可逆轉ACE、ACE2比例失衡，增加Mas表達，在血管緊張素轉化酶及受體層面，通過對ACE2/Ang-（1-7）/Mas通路的干預，逆轉RAS失衡。研究初步揭示了中醫藥治療高血壓早期血管重塑的分子機制和科學內涵，為高血壓血管重塑特點及病理機制研究提供新的證據，為中醫藥早期干預高血壓血管重塑提供科學依據;另一方面，將高血壓血管損傷的干預節點前移至早期富營養重塑階段，充分發揮了中醫“治未病”的優勢，為早期干預高血壓靶器官損害提供了新的思路。

[參考文獻]

[1] Cabandugama PK，Gardner MJ，Sowers JR. The renin angiotensin aldosterone system in obesity and hypertension：roles in the cardiorenal metabolic syndrome [J]. Med Clin N Am，2017，101（1）：129.

[2] 康玉明，李宏寶，齊杰，等.高血壓中樞發病機制的研究進展[J].西安交通大學學報：醫學版，2017，38（1）：1-6.

[3] 陶蓉.腎素-血管緊張素系統抑制劑治療高血壓的研究進展[J].上海醫藥，2013，34（19）：10-13.

[4] Forrester SJ，Booz GW，Sigmund CD，et al. Angiotensin Ⅱ Signal Transduction：An Update on Mechanisms of Physiology and Pathophysiology [J]. Physiol Rev，2018，98（3）：1627-1738.

[5] Mckinney CA，Fattah C，Loughrey CM，et al. Angiotensin-（1-7） and angiotensin-（1-9）：function in cardiac and vascular remodelling [J]. Clin Sci，2014，126（12）：815-827.

[6] Xu P，Sriramula S，Lazartigues E. ACE2/ANG-（1-7）/Mas pathway in the brain：the axis of good [J]. Am J Physiol-Reg I，2011，300（4）：R804-R817.

[7] 潘立敏，王洋，劉坤，等.天麻舒心方對SHR左心室超微結構及膠原的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2018， 16（5）：554-557.

[8] 王洋，劉坤，尹倚艱，等.天麻舒心方對自發性高血壓大鼠阻力血管富營養重塑的干預效果[J].北京中醫藥，2017， 36（4）：321-325.

[9] 郝瀟，李樹仁.血管緊張素-（1-9）心臟保護性作用研究進展[J].中國循環雜志，2015，30（12）：1247-1249.

[10] 吳劍，鄒云增.ACE/AngⅡ/AT1軸與ACE2/Ang（1-7）/Mas軸的平衡失調在心血管病中的作用[J].中國醫學前沿雜志：電子版，2013，5（6）：43-47.

[11] Zhang F，Hu YH，Xu QB，et al. Different effects of angiotensin Ⅱ and angiotensin-（1-7） on vascular smooth muscle cell proliferation and migration [J]. PLoS One，2010，5（8）：e12323.

[12] Zhang K，Meng X，Li D，et al. Angiotensin（1-7） attenuates the progression of streptozotocin-induced diabetic renal injury better than angiotensin receptor blockade [J]. Kidney Int，2015，87（2）：359-369.

[13] 柏松.新型腎素-血管緊張素系統治療高血壓的研究進展[J].中國當代醫藥，2016，23（16）：19-21.

[14] Wang Y，Tikellis C，Thomas MC，et al. Angiotensin converting enzyme 2 and atherosclerosis [J]. Atherosclerosis，2013，226：3-8.

[15] Iwai M，Nakaoka H，Senba I，et al. Possible involvement of angiotensin-converting enzyme 2 and Mas activation in inhibitory effects of angiotensin Ⅱ Type 1 receptor blockade on vascular remodeling [J]. Hypertension，2012， 60（1）：137-144.

[16] SeváPess？觝a B，van der Lubbe N，Verdonk K，et al. Key developments in renin-angiotensin-aldosterone system inhibition [J]. Nat Rev Nephrol，2013，9（1）：26-36.

[17] 喻江標，吳永港，張銀妝，等.ACE2-Ang（1-7）-Mas受體軸在高血壓射血分數保留心力衰竭中的作用[J].中南大學學報：醫學版，2018，43（7）：738-746.

[18] 張曉翠，侯兆玉，張紅利，等.血管緊張素1-7通過Mas受體減輕血管緊張素Ⅱ所致人腎小球內皮細胞損傷[J].中國病理生理雜志，2018，34（5）：893-898.

[19] Ohshima K，Mogi M，Nakaoka H，et al. Possible role of angiotensin-converting enzyme 2 and activation of angiotensin Ⅱ type 2 receptor by angiotensin-（1-7） in improvement of vascular remodeling by angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockade [J]. Hypertension，2014，63（3）：e53-e59.

[20] Castro MM，Rizzi E，Rodrigues GJ，et al. Antioxidant treatment reduces matrix metalloproteinase-2-induced vascular changes in renovascular hypertension [J]. Free Radical Bio Med，2009，46（9）：1298-1307.

（收稿日期：2018-08-07 本文編輯：任 念）