不同支氣管鏡介導標本的TB-DNA檢測對痰涂片陰性肺結核患者的診斷價值研究*

宋 健 鄧愛兵 李 楊 毛建軍 王 姜 張 帥 李真真 徐 鋒* 劉海燕

目前，肺結核的診斷主要依靠胸影像學、臨床癥狀及實驗室檢查綜合判斷，確診往往需痰液檢查到抗酸桿菌或痰抗酸桿菌培養陽性，但由于臨床癥狀及影像學表現不典型，加上由于化療、免疫功能障礙，結核桿菌的某些生物學特性發生變異，常規涂片檢查往往不易發現結核桿菌[3-4]。同時，痰菌含量少或呈L型結核菌、肺部病灶局限未與引流支氣管相通等因素，均可致使痰涂片檢查陰性[5]。由于氣管鏡可直觀肺部病變部位，并在病變部位直接取材(目前常用肺泡灌洗術取材)，極大提高了標本診斷陽性率，但其檢出率仍有待提高。采用氣管鏡毛刷刷檢送檢結核分枝桿菌基因(tuberculosis DNA，TB-DNA)的檢測方法國內尚未見報道。為明確針對肺結核患者診斷價值最高的檢測方案，本研究選取對痰涂片陰性結果的肺結核患者，采取不同取材方式對其進行診斷分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2016年10月至2018年4月滄州市人民醫院收治的234例痰涂片陰性肺結核患者，其中男性121例，女性113例；年齡16～67歲，平均年齡(38.15±5.24)歲；病程0.5～10個月，病程中位數3.6個月；220例患者存在咳嗽、咳痰及咯血等癥狀；63例患者存在不同程度的發熱；38例患者存在明顯的胸悶、氣促癥狀；136例患者X射線平片表現為密度不均勻的斑片狀低密度影、鈣化及空洞；單純表現為阻塞性肺炎41例；肺不張56例；17例患者存在結節、軟組織腫塊影；9例患者存在局限性肺氣腫；3例患者具有兩肺彌漫栗粒影。對所有患者行胸部CT檢查時發現：49例患者表現出斑塊狀浸潤影改變；67例患者具有支氣管擴張表現；9例患者檢出有局限性肺氣腫，且明顯可見局部支氣管狹窄。所有受檢者均用肺泡灌洗和毛刷刷檢收集痰液標本后行熒光定量PCR檢測TB-DNA。患者對檢測方案知情同意，并簽署同意書，本研究經過醫院倫理委員會審核。

1.2 納入與排除標準

(1)納入標準：①所有研究對象在入院后均存在不同程度的發熱、乏力、消瘦及呼吸困難等臨床表現，臨床表現結合多項影像學與實驗室檢查判定為疑似肺結核；②納入患者有纖維支氣管鏡及肺泡灌洗術和刷檢適應證；③痰涂片結核桿菌檢測為陰性結果。

(2)排除標準：①合并有多項重要器官功能障礙者；②孕婦、免疫抑制者；③有纖維支氣管鏡及肺泡灌洗術和毛刷刷檢禁忌證者；④嚴重肺動脈高壓；⑤本次研究檢查前1個月采用抗凝藥物進行治療；⑥支氣管肺活動性出血。

1.3 儀器設備

采用ET 260型電子支氣管鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.4 檢查方法

1.4.1 支氣管鏡檢查方法

采用ET 260型電子支氣管鏡(插入部外徑4.9 mm，工作孔道2.2 mm)對患者進行支氣管鏡的檢查，檢查方式參考《診斷性可彎曲支氣管鏡應用指南(2008年版)》[6]相關操作標準規范執行，檢查前參考血常規、凝血功能以及心電圖等常規檢查結果，對患者病情進行綜合評估。采用2%利多卡因進行麻醉處理后在電子支氣管鏡的輔助下對患者各段支氣管進行詳細檢查。參考胸部CT檢測結果對主要病變區域采用保護性套管黏膜刷刷檢，經鉗孔將黏膜刷插入至病變部位，稍加壓力旋轉刷擦3次，取出黏膜刷待檢。行支氣管肺泡灌洗處理，支氣管肺泡灌洗方法為：首先通過對患者胸部CT檢查圖像進行詳細分析，明確主要病變區域作為灌洗區域，后將支氣管鏡末端插入支氣管開口部位，選用0.9%氯化鈉注射液(NaCl)50 ml作為灌洗液，將灌洗液溫度控制在37 ℃左右，通過注射器由工作孔道注入20 ml灌洗液后進行負壓吸引回吸收灌洗液，需保證吸收率＞40%。

1.4.2 熒光定量PCR檢測TB-DNA

無菌灌洗瓶取回收的灌洗液5 ml，Eppendorf試管回收黏膜毛刷標本5 ml，各加入4% NaOH溶液，振蕩5 min，室溫放置30 min，2000 r/m離心10 min，棄上清液，在所得沉淀物樣本中加入50 μl DNA提取液，振蕩混勻后，行沸水浴10 min，10000 r/min離心5 min，取上清液進行DNA擴增。采用結核核酸檢測試劑盒進行檢測，嚴格遵照試劑盒說明書步驟進行操作。

1.5 觀察與評價標準

(1)肺泡灌洗液或黏膜毛刷標本培養分離得到分枝桿菌，后續鑒定明確為結核分枝桿菌，即可確診為肺結核。

(2)統計不同支氣管鏡介導標本的患者診斷陽性率。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行分析。計數資料采用n(%)表示，組間比較采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同介導標本的TB-DNA 檢測結果分析

肺泡灌洗液提取標本采用TB-DNA檢測顯示，234例患者中陽性144例，黏膜毛刷刷檢提取標本陽性213例，肺泡灌洗液提取標本陽性診斷率低于黏膜毛刷刷檢提取標本的陽性診斷率，差異具有統計學意義(x2=19.32，P＜0.05)，見表1。

表1 肺結核患者不同檢查方法的TB-DNA檢測結果

2.2 安全性分析

234例患者均順利完成支氣管鏡檢查，其中1例患者發生黏膜出血，2例氣促，1例氣胸，不良事件發生率為1.7%，給予對癥處理后均緩解。

3 討論

肺結核疾病臨床治療中早期準確診斷及采取針對性的治療方式對結核病患者預后有重要意義。有研究[7]指出，痰涂片抗酸染色在針對肺結核疾病臨床診斷中應用價值較為顯著，其具有簡便、快捷及特異性高的優點。但上述檢查方法在實際臨床應用時陽性檢出率較低，敏感度起伏程度較大，因此造成的誤診與漏診情況較為明顯[8]。Campos等[9]認為，入院治療的肺結核患者在進行痰涂片檢查時，超過50%的患者檢測結果均呈陰性，其認為造成上述情況發生的原因主要為：細菌負荷程度低、痰液質量低、涂片質量低、患者自身存在免疫缺陷以及引流支氣管不暢等。痰菌陰性的肺結核患者隱匿性極高，因此臨床診斷較為困難，同樣均有一定傳染性，對患者生活質量影響程度較高，甚至未經及時治療可能威脅到其生命安全。大多學者采用TB-DNA、痰涂片以及病理活檢等方法檢查，發現TB-DNA、痰涂片以及病理活檢對肺結核患者敏感度與特異性最高的為TB-DNA檢查[10-12]。在臨床應用中發現，所采用的病理活檢對肺結核患者具有一定的創傷性，且其檢測結果可能受到患者自身及外界多方面因素的影響，準確性還有待商酌[13]。涂片抗酸染色一直是檢測結核桿菌的首選方法，該檢測方式取樣簡便，操作簡單，檢測時間短，但部分肺結核患者排菌量較少，在取得樣本后送檢過程中容易受到外界因素影響，多次檢測重復性較差，因此檢測所得陽性表達率較低。肺泡灌洗液標本采用TB-DNA檢查與涂片檢查法對比而言其診斷靈敏度具有較為顯著的優勢，同時在臨床應用時具有檢測時間短、受外界影響程度低的優點[14]。黏膜毛刷刷檢作為一種新型技術已被臨床應用于肺結核的診斷，通常都采用的是涂片抗酸染色法，但對應用氣管鏡毛刷刷檢送檢TB-DNA的檢測方法國內尚未見報道。隨著氣管鏡技術的推廣普及，必將會給肺結核的快速準確診斷帶來更多的檢測方法，提供更廣闊的思路。

近年來，隨著支氣管鏡檢查技術在臨床中的飛速發展，其在針對肺結核患者的臨床診斷中逐漸受到重視。支氣管鏡檢技術在單獨應用時僅能對氣管支氣管結核進行診斷，而無法在內鏡觀察下對其他類型結核進行判斷[15]。支氣管鏡檢下毛刷刷檢取樣后進行細菌學以及病理學檢查，取得滿意效果，可有效提高對患者肺部病變情況的檢出。毛刷刷檢對于肺部疾病的診斷目前研究較少，王學敏等[16]通過纖維支氣管鏡下毛刷刷檢取液通過細胞學檢查在肺癌診斷中的陽性預測值為95.92%，診斷效能較高。然而本次研究中肺泡灌洗液提取標本采用TB-DNA檢測陽性檢出率為61.54%，明顯低于黏膜毛刷刷檢提取標本的陽性診斷率91.03%，差異明顯。在安全性方面所有患者均順利完成支氣管鏡檢查，不良事件發生率為1.7%，且給予對癥處理后均緩解。表明兩種取材方法安全可靠，且支氣管鏡下黏膜毛刷刷檢對疑難肺結核的診斷價值更高。

支氣管鏡下采用黏膜毛刷刷檢取材后行熒光定量PCR檢測TB-DNA對于痰涂片陰性肺結核患者具有較高診斷效能。