高效液相色譜法檢測脫毛類化妝品中巰基乙酸含量的不確定度分析

郝霞莉 李根池 曹 威

脫毛膏是較常見的一種脫毛類化妝品，主要成分是巰基乙酸(鈣)，其巰基可以與毛發中的蛋白結構相結合，使毛發溶解，以達到脫毛的目的，尤其適合怕痛而肌膚不易過敏的人群，因此倍受青睞[1]。巰基乙酸易經皮吸收，對人體產生較強的毒性。脫毛類化妝品作為人們常用且用量大的化妝品，其巰基乙酸含量是否在安全范圍直接關系到使用者的健康，因此對脫毛類化妝品中的巰基乙酸含量進行準確的測定顯得尤為重要[2-6]。通常，檢驗檢測機構采用國家標準化妝品衛生規范(2015版)中的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測定化妝品中巰基乙酸的含量，該方法相對簡單方便[7]。

為了評估HPLC方法中對檢測結果影響較大的不確定度因素，依據國家計量技術規范《測量不確定度評定與表示》(JJF 1059.1-2012)[8]的要求，對該方法測定結果的不確定度進行分析，為評定檢測結果的可靠程度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巰基乙酸標準品(95.0%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；乙腈[色譜純，ThermoFisher科技(中國)有限責任公司]；C8色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連伊利特公司)。

1.2 儀器與設備

Waters-2695型高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器紫外檢測器(美國Waters公司)；XP205DR分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；IKA MS3漩渦振蕩器[萊貝(上海)科學儀器有限公司]；MJ-300型超聲波清洗機(無錫市美極超聲設備有限公司)。

1.3 實驗方法

(1)標準溶液的配制。準確稱取30 mg(精確到0.1 mg)巰基乙酸標準品于25 ml容量瓶中。用流動相溶解并定容至刻度，配制成濃度為1200 μg/ml的標準儲備液。用流動相將巰基乙酸標準儲備液逐級稀釋成濃度分別為24 μg/ml、60 μg/ml、96 μg/ml、120 μg/ml以及180 μg/ml的標準工作液。

(2)試樣制備。精密稱取0.25 g樣品于25 ml具塞離心管中，加少許乙腈+水(10+90)渦旋60 s使樣品分散，繼續加乙腈+水(10+90)定容至接近刻度，超聲15 min，取出，定容至25 ml刻度，搖勻，取上層溶液，用0.45 μm有機系濾膜過濾。根據需要進行稀釋待測[9]。

(3)色譜條件。①色譜柱，伊利特C8 5μm，4.6 mm×250 mm；②流動相，乙腈+0.01 mol/L KH2PO4(磷酸調至pH值為2.5)=(10＋90)；③流速，1 ml/min；進樣量：10 μl；④柱溫，30 ℃；⑤檢測波長，215 nm；⑥檢測器，二極管陣列檢測器-2998。

(4)數學模型的建立。巰基乙酸的計算為：

式中X為試樣中巰基乙酸含量，μg/kg；C為從標準曲線得到巰基乙酸的質量濃度，μg/ml；V為樣品定容體積(ml)；m為樣品取樣量(g)。

(5)由于《化妝品安全技術規范》(2015版)中第四章3.9巰基乙酸是使用標準曲線法對試樣中巰基乙酸進行定性和定量檢測，所以試樣測定結果的不確定度除C、V、m外，標準曲線、試樣測量重復性、儀器進樣重復性和回收率都對測定結果產生影響。則由上式可轉化為：

式中R為回收率，f重為重復性修正因子，f校為校正曲線擬合修正因子。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

從測量過程和數學模型分析，試樣測定的相對標準不確定度主要由標準溶液配制urel(C)、試樣稱量urel(m)、試樣定容urel(V)、標準曲線擬合urel(C0)、試樣測量重復性urel(R)以及儀器進樣重復性urel(Q)幾個方面引入[10]。

2.2 各分量相對標準不確定度評定

2.2.1 標準溶液配制引入的相對標準不確定度urel(C)標準溶液由巰基乙酸標準品經過稱量、定容及稀釋配制而成，所以標準溶液配制過程引入的相對標準不確定度由標準品純度、天平稱量、標準儲備液定容和標準工作液稀釋而組成。

(1)標準品純度引入的不確定度urel(C1)。由巰基乙酸標準品證書可知，純度為95.0%，按均勻分布處理[11]。則其標準不確定度為：=0.02887，其相對標準不確定度為：

(2)天平稱量引入的不確定度urel(C2)。稱取巰基乙酸標準品使用的電子天平的檢定證書給出在d=0.01 mg、0≤m≤5 g條件下，其最大允許誤差為±0.05 mg，按矩形分布考慮[10]其引入的標準不確定度為：=0.02887mg， 精確稱量30 mg巰基乙酸標準品，其相對標準不確定度為：

(3)標準儲備液定容引入的不確定度urel(C3)。使用25 ml容量瓶定容巰基乙酸標準儲備液，依據JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[12]。20 ℃時25 ml容量瓶(A級)的容量允差為±0.030 ml，按三角分布考慮，其標準不確定度為：=0.01225ml ，其相對標準不確定度為：

巰基乙酸標準儲備液由10%乙腈配制而成，20 ℃時玻璃的體積膨脹系數為(2.5×10-5)℃[13]。乙腈的體積膨脹系數為(1.4×10-3)℃，水的體積膨脹系數為(2.1×10-4)℃，則10%乙腈水的平均體積膨脹系數為(1.64×10-4)℃[14-15]。假設25 ml容量瓶的使用溫度與室溫一致，實驗時室溫為23.9 ℃，則由校準溫度與使用溫度不同引起的體積不確定值為：

ΔV=V1-V2=(α平均-α玻璃)×V×ΔT=0.01355ml

按三角分布考慮，使用25 ml容量瓶時，其標準不確定度為：=0.005532ml，其相對標準不確定度為：

則合成標準儲備液定容的相對標準不確定度為：

(4)標準工作液稀釋urel(C4)。標準工作液由標準儲備液分別稀釋配制而成，使用了規格分別為5～50μl、20～200μl、100～1000μl、100～5000μl的移液器和10 ml容量瓶。依據移液器校準證書，當k=2時，這3種規格移液器的擴展不確定度依次為u(200 μl)=0.4 μl、u(1000 μl)=0.5 μl和u(5000 μl)=0.6 μl，則其標準不確定度分別為：

其各自相對標準不確定度見表1。

表1 標準系列配制過程中移液器校準引起的不確定度

使用10 ml容量瓶配制標準工作液，依據JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規程》[12]。20 ℃時10 ml容量瓶(A級)的容量允差為±0.020 ml，按三角分布考慮，其標準不確定度為：

其相對標準不確定度為：

巰基乙酸標準工作液由10%乙腈水配制而成，20 ℃時玻璃的體積膨脹系數為2.5×10-5/℃[13]；水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃[15]；乙腈的體積膨脹系數為1.4×10-3/℃，則10%乙腈水的平均體積膨脹系數為1.64×10-4/℃[14]。假設10 ml容量瓶的使用溫度與室溫一致，實驗時室溫為23.9 ℃，則由校準溫度與使用溫度不同引起的體積不確定值為：

按三角分布考慮，使用10 ml容量瓶時，其標準不確定度為：

其相對標準不確定度為：

則合成標準工作液稀釋過程的相對標準不確定度為：

則合成標準溶液配制的相對標準不確定度為：

2.2.2 試樣稱量引入的相對標準不確定度urel(m)

待測試樣同樣使用十萬分之一天平進行稱量，根據電子天平檢定證書，在d=0.1 mg、0≤m≤50 g條件下，其最大允許誤差為±0.5 mg，按矩形分布考慮，其標準不確定度為：

稱取試樣0.2515 g，其相對標準不確定度為：

2.2.3 試樣定容引入的相對標準不確定度urel(V)

使用100～5000 μl移液器移取1500 μl流動相定容試樣，依據移液器校準證書，當k=2時，U=0.6 μl，則其標準不確定度為：

則其相對標準不確定度為：

2.2.4 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(C0)

測定過程中采用1200 μg/ml的巰基乙酸標準儲備液配制成濃度分別為24 μg/ml、60 μg/ml、96 μg/ml、120 μg/ml和180 μg/ml的標準工作液，將這5個濃度的標準工作液分別上機檢測6次，測得的峰面積結果見表2。采用最小二乘法擬合，得到標準曲線的線性回歸方程為：Y=bX+a=4298.3X＋21958.2，相關系數r=0.9998，其中

峰面積測量的標準偏差為：

應用該曲線進行測量時，對被測試樣檢測10次，即p=10，測得試樣中巰基乙酸的濃度見表3。

由表3計算，試樣中巰基乙酸的平均濃度為32.085 μg/ml，試樣質量以0.2515 g計，得到的試樣中巰基乙酸的最佳估計值為3.189 μg/kg。

校準曲線擬合的標準不確定度為：

式中S為峰面積測量的標準偏差，數值為1506.33；b為校準曲線的斜率數值為4298.3；p為試樣測定次數，數值為10；n為校準溶液的測定次數，數值為30；Sxx為標準溶液濃度殘差的平方和，數值為84672；C0為試樣中巰基乙酸的平均濃度，數值為32.085 μg/ml；C 為巰基乙酸標準溶液的平均濃度，數值為96 μg/ml。

標準曲線擬合的相對標準不確定度為：

2.2.5 試樣測量重復性引入的相對標準不確定度urel(R)

對3.0 μg/kg濃度添加的試樣進行10次平行測定，所得結果見表4。

為確定回收率校準因子f重是否在計算公式中采用，對平均回收率進行了顯著性檢驗[10-11，13]。顯著性檢驗采用t檢驗，當檢驗值t大于或等于臨界值t(95，10)=2.23[10-11，13]時，則平均回收率與100%有顯著性差異，表明校準因子必須在計算公式中采用，用于修正結果，否則不采用。

本實驗t值為0.126，小于臨界值2.23，表明平均回收率與100%無差異顯著，在計算公式中可忽略校準因子。試樣測量重復性引入的相對標準不確定度為：

2.2.6 儀器引入的相對標準不確定度urel(Q)

對濃度為120 μg/L標準溶液進行6次重復測定，所得峰面積見表5。

表2 標準曲線擬合數據

表3 試樣液中巰基乙酸濃度結果

表4 試樣重復性測量結果

表5 重復進樣測量結果

單個峰面積的標準偏差為：

試樣測定平均值的A類標準不確定度為：

其相對標準不確定度為：

2.3 合成標準不確定度評定

根據各分量相對標準不確定度的評定，歸納出不確定度的分量、來源及相對標準不確定度見表6[12-13]。

由表6，合成相對標準不確定度為：

表6 相對標準不確定度總結

試樣中巰基乙酸含量的合成標準不確定度為：

u(X)=X·urel=3.189μg/kg×0.03180=0.1014μg/kg

通過對脫毛類化妝品中巰基乙酸含量的不確定度各分量的評定，由表6的數據可以看出：標準溶液配制、試樣測量重復性以及儀器進樣重復對結果的影響較大；其次是標準曲線擬合和試樣稱量；試樣定容引入的不確定度極小，可以忽略不計。

2.4 擴展不確定度評定

擴展不確定度由合成標準不確定度乘以包含因子得到，取置信水平95%，則k=2，脫毛類化妝品中巰基乙酸含量的擴展不確定度為：

用高效液相色譜法測定脫毛類化妝品中巰基乙酸含量，當取樣量為0.25g，k=2(置信水平95%)時，測得脫毛類化妝品中巰基乙酸含量為(3.189±0.2028)μg/kg。

3 結論

通過使用高效液相色譜法對脫毛類化妝品中巰基乙酸含量的不確定度各分量的測定，從最終數據分析，影響檢測結果的三大因素由大到小依次為標準溶液配制(B類評定)、試樣測量重復性(A類評定)及標準曲線擬合(A類評定)；其次是儀器進樣重復(A類評定)和試樣稱量(B類評定)；試樣定容(B類評定)引入的不確定度極小，可以忽略不計。從評定類型分析，六大分量中B類評定所占不確定度比A類評定小，B類評定不確定度主要來源于校準證書、廠家說明書、第三方權威機構發布的量值等客觀因素，A類評定不確定度主要來源于多次測量所得量值等主觀操作[16]。

為提高檢測數據的準確性，在實際的檢驗檢測過程中可通過提高標準品純度、調整實驗環境溫度以及使用精確的移液量器來減小標準曲線配制過程中產生的誤差；可通過依據樣品實際濃度合理設置標準曲線、增加標準曲線各濃度點的測定次數來減小標準曲線擬合產生的不確定度；試樣前處理操作過程中產生的誤差可通過制定規范的實驗操作規程以及使用檢定合格的計量器具，盡量減小干擾，從而保證檢驗結果的準確性[10]。