鼻炎癥狀兔的細菌感染情況調查與分析

趙巧雅，吳 靜，姜亦飛，孫海濤，譚善杰，黃 兵

（1.山東省農業科學院家禽研究所，濟南 250023；2.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，濟南 250100；3.臨沂市畜牧獸醫局，山東 臨沂 276001）

家兔鼻炎是規模化養兔場和個體養殖戶經常發生的臨床癥狀，其病因極為復雜，直接影響家兔出欄率，給養兔戶造成一定的經濟損失［1］。傳統微生物鑒定方法主要是通過革蘭氏染色鏡檢、生化反應以及利用伯杰氏手冊等材料進行對比分析，存在精度低、不利于大批量菌群分析鑒定等缺點［2-3］。而16S rRNA存在于所有細菌染色體中，利用16S rRNA測序技術對樣品中的細菌進行系統鑒定，具有高通量、可實現不可培養細菌的準確鑒定等一系列優勢［4］。本試驗采用傳統方法結合測序對鼻炎癥狀兔的帶菌情況進行了分析，為兔場防治及合理治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從山東某規模化兔場出現鼻炎癥狀兔中隨機采集鼻腔棉拭子25份，12 h內進行細菌分離培養。

1.2 主要試劑

pMD-18T克隆載體購自TAKARA公司；PCR擴增試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自Axygen公司，酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂粉等細菌培養基及其他試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 細菌分離培養

將樣品在SC肉湯（亞硒酸鹽-半胱氨酸肉湯）中，37℃、18～24 h預增菌進行選擇性培養后，用接種環以劃線形式接種到5%胎牛血清培養基，37℃培養過夜。在培養基上分別挑取典型或可疑菌落，革蘭氏染色鏡檢。

1.4 16S rRNA基因測序

取單個細菌菌落懸浮于50 μL生理鹽水作為模板，使用16S通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和 1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT）進行 PCR 擴增。反應體系：模板 1μL，上下游引物（20 pmol/μL）各0.5 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，補充去離子水至 25 μL。PCR 反應條件：94℃預變性 5 min，94℃變性 40 s、53℃復性 40 s、72℃延伸 1 min，35個循環，最后 72℃預變性10 min。將PCR產物克隆到pMD-18T載體上，送北京擎科新業生物技術有限公司測序分析。

1.5 藥敏試驗

無菌條件下將純培養的細菌按照WHO推薦的瓊脂紙片擴散法（K-B）［5］，分別挑取分離的純培養菌的單菌落用無菌生理鹽水稀釋，吸取200 μL菌液均勻涂布于普通瓊脂平板，用無菌小鑷子夾取各類藥敏片，平貼于平板表面，37℃培養24 h，測定抑菌圈大小，藥敏結果按NCCLS標準作出判定。

2 結果

2.1 分離菌培養特征及形態觀察

各分離菌株經常規培養、顯微鏡觀察后初步分離出151個菌株，分別編號為A1、A2…A151，部分菌落形態及細菌形態如圖1所示。

圖1部分檢出菌鏡檢圖

2.2 16S rRNA基因測序結果

對所有分離菌進行16S PCR擴增，擴增產物經1%凝膠瓊脂電泳驗證，均成功擴增。將測序結果輸入GenBank進行同源性檢索，所有分離株與對應標準菌株的同源性均在94%～100%之間。基因測序結果顯示，大部分菌株為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和奇異變形桿菌，此外還檢測出鮑曼不動桿菌、波氏桿菌、枯草芽孢桿菌、多殺性巴氏桿菌以及綠膿桿菌等，各類菌數量及所占百分比如表1。

2.3 藥敏試驗結果

對8種鑒定菌進行藥敏試驗，結果如表2所示。所有檢出菌對紅霉素、磺胺異噁唑的耐藥率最高，其次為阿奇霉素和慶大霉素。所有分離菌均對阿米卡星不耐藥。枯草芽孢桿菌對15種抗生素敏感性均較高。

表1各分離菌數量及百分比

表2鑒定菌藥敏試驗結果

3 討論

近年來，隨著兔規模化養殖業的發展，兔鼻炎的發病率呈上升趨勢，直接影響兔群的出欄率，且病因極為復雜［6］。本試驗從山東省某兔場25只鼻炎癥狀兔的鼻腔棉拭子中分離得到了151株細菌，經16S rRNA基因測序及序列比對，發現大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌等8種細菌為主要菌群。根據臨床癥狀、各分離菌的種類及所占比例，該場鼻炎兔的病原菌疑為多殺性巴氏桿菌、波氏桿菌及金黃色葡萄球菌混合感染。

本研究的藥敏試驗結果表明，所有檢出菌對紅霉素、磺胺異噁唑的耐藥率最高，所有分離菌均對阿米卡星不耐藥，可對該場及該地區鼻炎兔的用藥治療提供參考及指導作用。本研究與朱芝秀等［7］、曾彥欽等［8］報道中的同類細菌的藥敏結果存在較大差異，這是由于臨床用藥的差異，以及各養殖場、各地區對細菌的種類和耐藥譜差異很大。因此，建議規范管理兔場及合理使用抗生素，定期對分離菌株進行抗生素敏感性檢測，對有效防止兔場疾病發生有重要意義。