魯中肉羊HIRA基因多態性及其與產羔數的關聯分析

張仁森，劉秋月，潘林香，王金文，王翔宇，胡文萍，馬 琳，狄 冉，儲明星

（1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，農業部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.萊蕪市嬴泰有機農業科技發展有限公司，山東 萊蕪271114；3.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，濟南 250100）

家畜的產（羔）仔數是一種重要的經濟性狀，提高產（羔）仔數對于提高畜牧業產值具有重要意義［1］。綿羊產羔數是一種數量性狀，受多基因調控，而其遺傳力僅為0.1左右［2］，因此通過常規育種技術提高綿羊產羔數耗時極長，效率低下。標記輔助選擇可以通過影響選擇的時間、強度以及準確性來極大地提高這類低遺傳力性狀的選擇效率［3］。因此，尋找影響綿羊產羔數的分子遺傳標記是實現綿羊產羔數標記輔助選擇的先決條件。

全基因組重測序是目前挖掘功能基因的一種重要方式［4-8］。本實驗室前期對10個綿羊品種的99個個體進行全基因組重測序，定義Z（Fst）＞5為顯著位點，篩選獲得可能與綿羊產羔數相關的候選基因HIRA（Histone cell cycle regulator）及其突變位點（g.71874104 G＞A及g.71833755 T＞C，其中g.71874104 G＞A位點位于啟動子上游區域，g.71833755 T＞C位點位于內含子區域，該位點突變導致在該位置的氨基酸從親水性谷氨酰胺變為堿性精氨酸），其Z（Fst）值為7.1，提示該基因可能與綿羊產羔數相關。HIRA是一種組蛋白調節基因，它位于綿羊17號染色體上，由27個外顯子和26個內含子組成，編碼1 091個氨基酸，其產物HIR/HIRA是組蛋白伴侶蛋白，其主要功能是輔助組蛋白完成核小體的解聚和重新裝配，從而參與轉錄調節、基因沉默、細胞衰老等多種生物學過程［9］。HIRA的基因產物包含著一組保守的蛋白家族，在多種生物體如酵母、果蠅、小鼠、人類以及植物等中都有發現［10-11］，其對維持基因組的完整性以及細胞穩態具有重要作用［12］。HIRA基因首先在酵母中發現［13］，隨后對HIRA基因的研究越來越多。研究發現，HIRA與異染色質區域的沉默和假轉錄本的抑制等有關，其缺失或突變會導致胚胎發育障礙、雌性不育等多種生理缺陷［14-19］。目前未見HIRA基因與魯中肉羊產羔數之間關系的研究報道。

魯中肉羊原產山東萊蕪，是利用肉用性能好的白頭杜泊羊與繁殖率高的湖羊雜交育種而成，具有增重快、料肉比高、抗粗飼、抗病、適合圈養等特點［20］。本研究以魯中肉羊為對象，利用實驗室前期重測序結果結合Sequenom MassARRAY?SNP技術對其HIRA基因g.71874104 G＞A和g.71833755 T＞C位點進行分型，探討魯中肉羊HIRA基因SNP位點的多態性，并分析其與魯中肉羊產羔數的關聯性，為魯中肉羊產羔數的分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 血樣采集及數據測定

試驗所用384只魯中肉羊血樣采自山東省萊蕪市嬴泰有機農業科技發展有限公司。羊只營養以及管理水平均保持一致，年齡相近。采取頸靜脈采血，檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃保存。同時記錄其產羔季節、胎次與產羔數。

1.2 DNA提取

魯中肉羊血液樣本DNA使用TIANGEN（天根）血液DNA試劑盒提取，使用Nano Drop2000檢測DNA樣本濃度，DNA質量使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3 基因分型

對HIRA基因2個多態位點在魯中肉羊中進行基因分型，采用Sequenom MassARRAY?SNP技術進行基因型檢測［21］。分型樣品為DNA，每個樣品需要量為20 μL，DNA 濃度為 40～80 ng/μL。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2016軟件統計魯中肉羊HIRA基因2個多態位點基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量、雜合度和有效等位基因數，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。產羔數關聯分析如本實驗室田志龍等［22］之前所述，采用SPSS19.0軟件程序中一般線性模型完成魯中肉羊基因型與產羔表型數據關聯分析，所有數據以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 HIRA基因多態性分析

根據基因分型結果，發現魯中肉羊HIRA基因g.71833755 T>C位點存在TT、TC和CC三種基因型

圖1 HIRA基因g.71833755 T＞C位點分型結果

對上述2個位點在魯中肉羊中的基因型頻率和等位基因頻率分別進行了統計，并計算上述2個位點在群體中的多態信息含量、雜合度和有效等位基因數，并用卡方檢驗檢測2個位點在群體中的平衡狀態，結果見表1。

圖2 HIRA基因g.71874104 G＞A位點分型結果

從表1可知，魯中肉羊HIRA基因g.71833755 T>C（圖1），g.71874104 G>A位點存在AA、AG和GG三種基因型（圖 2）。位點在魯中肉羊中表現為低度多態（PIC<0.25），g.71874104 G>A位點在魯中肉羊中表現為中度多態（0.25C位點在魯中肉羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態（P<0.05），g.71874104 G>A位點在魯中肉羊中處于哈代溫伯格平衡狀態（P>0.05）。

表1 HIRA基因2個多態位點的群體遺傳學分析

2.2 HIRA基因g.71833755T>C位點和g.71874104 G>A位點與魯中肉羊產羔數的關系

從表2可以初步得出，HIRA基因g.71874104 G>A位點多態性與魯中肉羊第2胎、第3胎產羔數顯著關聯（P<0.05），雜合型AG個體各胎產羔數均高于野生型GG和突變純合型AA個體，其中AG型個體第2胎產羔數顯著高于AA型個體（P<0.05），第3胎產羔數顯著高于GG型個體；g.71833755 T>C位點多態性與魯中肉羊第2胎產羔數顯著關聯（P<0.05），雜合型TC個體第2胎產羔數均高于野生型TT（P>0.05）和突變純合型CC個體（P<0.05）。

表2 HIRA基因不同位點各基因型魯中肉羊產羔數最小二乘均值及標準誤 只

3 討論

3.1 HIRA基因多態性分析及其與動物胚胎成活率之間的關系

HIRA基因g.71833755 T>C與g.71874104 G>A位點在NCBI中已有報道，但這兩個位點與魯中肉羊產羔數關聯分析方面未有文獻報道。群體多態信息含量分析發現，g.71874104 G＞A位點在魯中肉羊中處于中度多態（0.25＜PIC＜0.5），表明該位點在魯中肉羊中存在較強的選擇潛力；而g.71833755 T＞C位點在魯中肉羊中表現為低度多態（PIC＜0.25），表明該位點在魯中肉羊中選擇潛力較小。可見，不同位點在同一綿羊品種中受到的選擇強度不同。卡方適合性檢驗結果表明，g.71874104 G＞A位點在魯中肉羊中處于哈代溫伯格平衡狀態（P＞0.05），表明經過長期進化和選擇，該位點在適應性方面具有一定的遺傳優勢；而g.71833755 T＞C位點在魯中肉羊中處于哈代溫伯格不平衡狀態（P＜0.05），這可能是因為該位點受地域差異或者人工選擇的影響較大，也可能是因為所使用的樣本數偏少造成的。

排卵數和胚胎成活率是影響產羔數的重要指標［23］。在實際生產實踐中發現胚胎數目多并不一定意味著實際的產羔數一定多。周梅等［24］研究發現，部分小尾寒羊母羊能夠產生4～5個胚胎，然而最終的產羔數卻只有2～3 個。Dilg 等［25］和 Pchelintsev 等［26］研究表明，HIRA基因的突變是導致胚胎死亡的重要因素。王玉鳳等［27］研究發現，果蠅中過表達的dHira將會影響與細胞周期有關的基因表達，使早期胚胎的細胞核分裂不能同步，進而導致果蠅早期胚胎的大量死亡。王孟雨等［28］研究了HIRA敲除對銀鯽胚胎發育的影響，結果發現HIRA的敲除會導致銀鯽體節發育異常、循環系統障礙、圍心腔水腫等胚胎發育異常現象，且伴隨著出苗后魚苗的大量死亡現象。Roberts等［18］研究發現，HIRA的突變會影響小鼠中內胚層的發育和分化，導致脊索、神經管及心臟回路發育缺陷，甚至導致胚胎在孕中期死亡。Nashun等［29］研究發現，HIRA的缺失會導致小鼠原始卵泡細胞的嚴重發育缺陷以及大量的卵母細胞死亡。Clift等［30］研究發現，HIRA的缺失會影響小鼠基因組中的核小體裝配過程，導致無法形成雄性原核。Lin等［31］研究發現，HIRA突變的雌性小鼠能夠正常排卵，但其在與野生型雄性交配后無法產生后代。然而在本研究中，HIRA基因 g.71874104 G＞A位點和g.71833755 T＞C位點突變均不會導致母羊不育，且二者的突變雜合子在魯中肉羊中產羔數均最高，表明這兩個位點突變雜合子母羊產生的卵子能夠參與正常的受精過程，且形成的合子可能具有最強的胚胎發育能力，這與前人在其他物種中的研究結果并不一致。推測這可能與物種之間的差異有關，具體原因需要進一步的實驗證明。

3.2 HIRA基因多態性與魯中肉羊產羔數之間的關系

關聯分析表明，g.71874104 G＞A和g.71833755 T＞C位點的突變對魯中肉羊產羔數影響較大，這與Zhou等［32］在小尾寒羊中的研究結果相一致。在Ensemble數據庫中查找發現g.71874104 G＞A位點位于HIRA基因轉錄起始位點上游255 bp處，因此，很有可能該突變位點位于HIRA基因的啟動子區域，推測該位點的突變可能通過影響HIRA基因轉錄從而最終影響魯中肉羊的產羔數，這需要進一步的實驗證明。研究表明，動物的表型性狀可因為基因某些位點的突變而顯著改變［33-35］。g.71833755 T＞C位點突變導致在該位置的氨基酸從親水性谷氨酰胺變為堿性精氨酸，但是該突變是如何影響魯中肉羊產羔數性狀的有待進一步研究。

4 結論

HIRA基因g.71874104 G＞A位點多態性與魯中肉羊第2胎、第3胎產羔數顯著關聯；g.71833755 T＞C位點多態性與魯中肉羊第2胎產羔數顯著關聯。綜上，g.71874104 G＞A位點的A等位基因及g.71833755 T＞C位點的C等位基因可能是提高綿羊產羔數潛在有效的DNA標記。