SSR標記技術在“七星”青蘿卜雜交種純度鑒定中的應用

(1.天津科潤蔬菜研究所，蔬菜種質創新國家重點實驗室，天津市蔬菜遺傳育種企業重點實驗室，天津 300384；2.天津大學生命科學學院，天津 300072)

蘿卜(RaphanussativusL.)又名萊菔，屬十字花科蘿卜屬，是我國重要的蔬菜作物之一。據統計，我國每年蘿卜播種面積保持在120萬hm2左右，總產量達4 000 t，是僅次于白菜的第二大蔬菜作物[1-2]。“水果蘿卜”是人們對蘿卜中最適宜生食、味佳形美、可與水果媲美的優良品種類型的統稱。肉質翠綠的天津“衛青蘿卜”和山東“濰縣蘿卜”是水果型青蘿卜中頗負盛名的2個地方品種[3]。“七星”青蘿卜是天津科潤蔬菜研究所育成的水果蘿卜雜交新品種，其肉質根長圓柱形，外形美觀，表皮淺綠色、光滑亮澤，肉色綠，口感脆甜，生食品質極佳，春秋均可種植，近3年在國內累計應用面積已超過2 600 hm2以上[4]。

種子純度是保證優良品種潛力得以發揮的關鍵因素，目前傳統的種子純度鑒定方法，仍以田間觀察為主，具有工作量大、周期長、易受環境影響等不利因素，由于需要較長的觀察周期，還可能錯過最佳的銷售和播種時間。基因組水平的分子標記具有遺傳穩定、多態性高等優點，目前已被廣泛應用于蔬菜作物的種子純度檢測當中[5-6]。張小康等[7]利用SSR標記對漢青一號蘿卜雜種一代進行純度鑒定，結果純度為95.1%，與田間鑒定結果96.0%基本相符。任雪松等[8]利用RAPD標記對胭脂蘿卜種子進行純度鑒定，發現其純度為72.7%，與田間檢測結果一致。本研究通過篩選合適的SSR引物，來完成“七星”青蘿卜的種子純度鑒定，以期為建立準確、高效的雜交種分子純度鑒定技術體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

“七星”青蘿卜雜交種及其父母本，市售青蘿卜商品種10份，均由天津科潤蔬菜研究所大白菜研究室提供。

表1 商品種來源

代號商品名來源1西星蘿卜5號山東登海種業股份有限公司2琴萌青青島國際種苗有限公司3德高青德高蔬菜種苗研究所4喜諾青蘿卜青島金海種苗有限公司5喜諾曉青青島金海種苗有限公司6喜諾春青綠青島金海種苗有限公司7蘋果脆山東昌邑市隆達種業8青脆甜北京中農金土地農業發展研究中心9菜星青秀山東省泰安菜星種業有限公司10春夏青玉青島金海種苗有限公司

注：白色箭頭指出的為假雜種。圖1 引物QX-SSR 1在七星蘿卜雜交種群體中的擴增結果

1.2 方 法

1.2.1樣品DNA提取

參試材料播種于露地，正常管理，2～3片真葉時采集幼嫩葉片，利用CTAB法提取基因組DNA，具體的步驟為：取幼嫩葉片0.1 g入1.5 mL離心管中，加50μL 2% CTAB提取緩沖液，研磨，后補齊至400μL，65 ℃水浴30 min；加入400μL氯仿∶異戊醇(24∶1)，輕搖5 min。12 000 r/min離心5 min；取上清200μL，加入預冷的異丙醇200μL混勻，-20 ℃放置20 min；12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入150μL預冷乙醇，輕輕混勻洗凈，10 000 r/min離心5 min；棄上清，晾干或吹干；加蒸餾水100μL溶解DNA，室溫放置1 h；用蒸餾水將DNA稀釋到50 ng/μL，作為PCR模板使用或-20 ℃保存備用。

1.2.2SSR 擴增與電泳分析

采用10μL的反應體系，包括：10×PCR Buffer，1.0μL；2.5 mM dNTP，0.2μL；10μmol/L primers，0.4μL；5 U/μL Taq，0.2μL；50 ng/μL DNA，1.5μL；ddH2O，6.7μL。

PCR擴增采用的程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃終延伸5 min。

對PCR擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過銀染后觀察結果。

1.2.3引物篩選

根據蘿卜基因組信息，設計SSR引物在七星蘿卜親本及F1代間進行篩選，篩選具有共顯性差異標記條帶的引物進行純度鑒定。

1.2.4數據處理與結果分析

數據統計方法參照薛艷等[9]的方法。

SSR純度(%)=(檢測株數-母本帶型數-父本帶型數)/檢測株數×100%。

田間鑒定：試驗中所用的材料進行正常管理，根據成熟期的田間表現進行調查，田間鑒定純度(%)=(檢測株數-父本株數-母本株數)/檢測株數×100%。

2 結果與分析

2.1 引物篩選結果

根據蘿卜基因組信息，設計了20對SSR引物在七星蘿卜親本及F1代間進行多態性篩選，獲得了具有共顯性差異標記條帶的引物對QX-SSR 1，該標記重復性好，條帶清晰，序列如下：

上游引物：5’-ATAATGGAAATCCCTGACCA-3’

下游引物：5’-AGCAAATGAAAGGCAAAACT-3’

用該引物對在七星蘿卜雜交種中能同時擴增出133 bp和138 bp兩條帶，七星母本僅擴增出138 bp的條帶，七星父本僅擴增出133 bp的條帶。

2.2 雜交種純度的SSR鑒定

為驗證準確性，利用篩選到的引物QX-SSR 1對七星蘿卜雜交種的純度進行鑒定，結果表明雜交種純度為94%(圖1)，與田間鑒定結果94%一致，說明分子標記鑒定結果準確，可以應用于七星蘿卜雜交種純度的快速檢測。

2.3 引物特異性驗證

為驗證篩選獲得的引物QX-SSR 1的特異性，收集市場上常見的10個青蘿卜商品種，提取商品種的基因組DNA作為模板，用引物QX-SSR 1為特異性引物進行PCR擴增，跑膠檢測，發現10個商品種的電泳結果都只有1條特異性條帶(圖2)，與七星蘿卜商品種2條不同條帶的結果(圖1)完全不同，說明該引物不僅能用于區分七星蘿卜雜交種中的假雜種，還能用來區分七星蘿卜與其他青蘿卜商品種，具有很高的特異性。

圖2 引物QX-SSR 1在10個青蘿卜商品種中的擴增結果

3 結 論

蘿卜田間純度鑒定一般需要2～3個月的時間，易受種植環境的影響，造成鑒定結果不準確，較長的鑒定周期可能會導致商品種錯過最佳銷售時期。利用SSR分子標記進行純度鑒定從播種到獲得檢測結果只需要1周左右的時間，而且鑒定結果不受環境條件以及人為因素的影響，與田間鑒定相比有簡便、快速、準確等顯著優勢。

本研究利用新開發的引物QX-SSR 1對七星蘿卜雜交種的純度進行鑒定，結果表明，雜交種純度為94%，與田間鑒定結果94%一致，說明該分子標記鑒定結果準確，而且經多批次檢測，均表現穩定，此外該引物不僅能區分出七星青蘿卜雜交種中混入的父、母本，還能夠區分出七星青蘿卜與其他青蘿卜商品種，具有很高的應用價值。