火龍果miRNA表達(dá)分析的qRT-PCR檢測(cè)體系建立

(貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/生命科學(xué)學(xué)院，山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025)

MicroRNA(miRNA)是由19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA[1-2]，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)切割靶基因、抑制翻譯、介導(dǎo)DNA甲基化等過(guò)程實(shí)現(xiàn)調(diào)控功能[3]，參與植物形態(tài)建成、激素應(yīng)答和逆境脅迫等生物學(xué)過(guò)程[4-6]。近年來(lái)，如何精準(zhǔn)檢測(cè)miRNA是否表達(dá)及表達(dá)量成為研究重點(diǎn)，目前的檢測(cè)方法主要有原位雜交、Northern blot和qRT-PCR等，其中qRT-PCR以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，已成為基因檢測(cè)的首選方法[7]。由于長(zhǎng)度短小，miRNA的qRT-PCR與普通PCR不同，前者需延長(zhǎng)待測(cè)miRNA的長(zhǎng)度，構(gòu)建出足夠長(zhǎng)的PCR模板。目前，基于莖環(huán)法[8]和多腺苷酸聚合酶加尾法(poly A polymerase，PAP)[9]設(shè)計(jì)特異引物，采用qRT-PCR技術(shù)成為miRNA的常用檢測(cè)方法。同時(shí)，由于RNA數(shù)量和質(zhì)量等因素可能會(huì)影響miRNA的檢測(cè)效果，常規(guī)qRT-PCR的內(nèi)參基因不適合miRNA檢測(cè)[10]。因此，特異引物的設(shè)計(jì)和內(nèi)參基因的選擇成為植物miRNA檢測(cè)的關(guān)鍵。

貴州屬南亞熱帶和中亞熱帶氣候，在喀斯特高溫干旱地區(qū)火龍果已成為新、特、優(yōu)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目[11]。火龍果具有較強(qiáng)的抗逆性且易于栽培等特性[12-15]，在生產(chǎn)上有廣闊的發(fā)展前景。為進(jìn)一步從非編碼基因方向理解火龍果抗逆分子機(jī)理，本課題組在前期進(jìn)行了干旱脅迫下火龍果小RNA組測(cè)序，獲得了大量miRNA序列。迄今，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于火龍果miRNA的qRT-PCR檢測(cè)。因此，火龍果miRNA內(nèi)參基因的篩選及qRT-PCR檢測(cè)體系的建立亟待解決。從小RNA組測(cè)序結(jié)果中選取了干旱脅迫下差異顯著表達(dá)的miR 396 b，分別使用莖……