丙泊酚通過降低眶額葉皮層神經(jīng)元興奮性下調大鼠認知功能研究*

楊明友 ，張 超 ，葉建寧 ，張 銘 ，易 斌 ，魯開智 ，王文聰 ，3△

（1.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院手術麻醉科，重慶 400038； 2.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，重慶 400038； 3.三博江陵醫(yī)院麻醉科，重慶 400021）

丙泊酚是臨床常用靜脈麻醉藥物［1-3］。研究表明，丙泊酚麻醉后受試者不能維持覺醒，表現(xiàn)出學習記憶和決策等認知功能下調［4-6］。目前，丙泊酚麻醉如何下調學習記憶功能的神經(jīng)機制尚不完全清楚。有研究表明，丙泊酚可直接作用于學習記憶相關的海馬和內嗅皮層腦區(qū)。在海馬區(qū)，丙泊酚可抑制神經(jīng)元興奮性，降低突觸傳遞效率和可塑性，并抑制乙酰膽堿遞質釋放［7-11］；同時，下調內嗅皮層神經(jīng)元的活動［12］。眶額葉皮層興奮性與覺醒程度密切相關，并對學習記憶、決策及執(zhí)行功能起重要作用。在靈長類和嚙齒類動物中，損毀眶額葉皮層可損害動物的反轉學習記憶功能和認知的靈活性［13-16］。采用正電子計算機斷層（PET）技術監(jiān)測人腦活動，發(fā)現(xiàn)丙泊酚麻醉率先使眶額葉皮層活動下降，而對其他新皮層作用較小［17］，提示眶額葉與丙泊酚麻醉密切相關。本研究中通過神經(jīng)藥理學、免疫組化及行為學檢測方法，探討在眶額葉皮層微注射丙泊酚對學習記憶功能及神經(jīng)元活動的影響，以期進一步闡明丙泊酚麻醉效應，特別是麻醉中認知下調的神經(jīng)機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

動物與分組：健康雄性SD大鼠26只，2個月月齡，清潔級，體質量250～300 g，雄性，購于陸軍軍醫(yī)大學動物中心，動物合格證號為SCXK（渝）-PLA-20160011，實驗操作符合陸軍軍醫(yī)大學動物倫理規(guī)范。行為實驗中，共使用26只大鼠：14只大鼠隨機分為2組（溶劑對照組和丙泊酚處理組，各7只，用于T-迷宮實驗監(jiān)測反轉學習記憶；12只大鼠隨機分為2組（溶劑對照組和丙泊酚處理組，各6只，用于開場實驗。

試藥：丙泊酚（批號為 56931，分析純，純度≥98% ），多聚甲醛（批號為 16005，純度≥98% ），4′，6-二脒基 -2-苯基吲哚（DAPI），批號為 D9542，純度≥98%），均購于美國Sigma公司；c-fos免疫組化染色的一抗（批號為ab208942）和二抗（批號為ab150113）均購于英國Abcam公司。

儀器：IVM-1000型微量注射泵（英國Scientifica）；T-迷宮行為檢測裝置及配套動物軌跡視頻追蹤系統(tǒng)，開場行為檢測設備及配套動物軌跡視頻追蹤系統(tǒng)（中國上海欣軟信息科技公司）；CM 1900型冰凍切片機（德國Leica公司）；腦立體定位儀（中國深圳瑞沃德公司）。

1.2 方法

1.2.1 埋置給藥導管及微量給藥

將大鼠用3%戊巴比妥鈉進行麻醉（每100 g體質量0.25 mL，腹腔注射），置腦立體定位儀，用酒精和碘伏消毒后，剪開顱骨表面皮膚及去除軟組織，暴露顱骨。用過氧化氫擦拭顱骨表面，暴露前囟和后囟點。明確眶額葉額葉皮層定位坐標（anteroposterior：+3.7 mm，middle-lateral：±2.5 mm，dorsoventral：-4.0 mm）。根據(jù)上述坐標，用牙科鉆制作下導管的骨孔，在骨孔周圍安裝固定螺絲，完成后用微推將導管（中國深圳瑞沃德公司）埋植于眶額葉皮層。用牙科水泥將固定螺絲和導管固定。手術完成后，將大鼠置飼養(yǎng)籠恢復，恢復5～7 d后進行T-迷宮或開場實驗檢測。

采用微量注射泵進行微量給藥，在眶額葉給藥體積為 0.5 μL，丙泊酚的濃度為 50 μmol／L［12，18］。微量給藥速度為每 2 min0.5 μL，給藥完成后留針 2 min，使藥物擴散。給藥后15 min進行T-迷宮或開場實驗檢測。

1.2.2 T-迷宮檢測反轉學習記憶能力

限食：訓練前4 d進行食物攝取限制（每天給予大鼠約10～15 g食物），使大鼠體質量降至85%。

環(huán)境適應：在動物進行限食過程中，同時讓大鼠在T迷宮中適應，讓動物在撒有食物粒的T-迷宮中自由探索8～10 min。

T-迷宮測試：T-迷宮主要由1個中心臂及2個選擇臂構成（各臂長50 cm，寬20 cm）。共訓練10 d，前6 d將食物固定于T-迷宮的左側，每天進行10次訓練，每次間隔30 s。訓練時讓大鼠從中央臂的起點出發(fā)到左右的選擇臂尋找食物（放于選擇臂末端）。訓練6 d后，將食物放于T-迷宮的右側，繼續(xù)訓練4 d。每次訓練前，眶額葉皮層給予溶劑或丙泊酚，給藥15 min后進行訓練。動物若能準確找到食物，記錄1次正確的選擇；反之，則記錄為1次錯誤的選擇。

1.2.3 開場實驗

開場為1 m×1 m×1 m的盒子（開口、黑色）。每只大鼠僅接受1次測試，測試前15 min在眶額葉皮層給藥。大鼠放于入開場的中心區(qū)域，自由探索5 min。利用視頻追蹤系統(tǒng)檢測大鼠在開場中的運動距離、站立次數(shù)、進入中心區(qū)域的次數(shù)及距離。

1.2.4 導管埋置位點檢測

完成行為檢測后，采用生理鹽水（37℃）+4%多聚甲醛（4℃）進行灌注和固定。灌注固定后取腦組織。大腦在4%多聚甲醛中固定，完成后轉移至30%蔗糖+4%多聚甲醛溶液中進行脫水。腦組織沉底后，進行冰凍切片（厚度40 μm）。按冠狀面對眶額葉皮層連續(xù)切片，對切片進行DAPI染色。完成后進行封片，在熒光顯微鏡下檢測導管埋置位置是否位于眶額葉皮層。導管埋置不準大鼠不納入統(tǒng)計。

1.2.5 c-fos免疫組織化學熒光染色

按照1.2.1項下方法操作，在眶額葉皮層微量注射溶劑和丙泊酚。為排除眶額葉皮層自身晝夜節(jié)律影響，注射溶劑和丙泊酚在固定時間點（19：00）。完成注射90min后，按照1.2.4項下方法進行灌注固定。將腦組織置4%多聚甲醛外固定過夜，30%蔗糖［磷酸緩沖鹽溶液（PBS）配置］脫水過夜。切片 30 μm，PBS 中保存。一抗染色，濃度 1 ∶200，4 ℃ 24 h，室溫 2 h，PBS 漂洗 10 min，共 3次。DAPI染色 5 min，1×PBS漂洗 10 min 1次，二抗避光染色，濃度為 1∶200，2 h，1×PBS漂洗 10 min 3次。貼片后80%甘油封片，顯微鏡下觀察眶額葉皮層c-fos的表達。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0和Sigma Plot軟件分析。計量資料用表示，采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 引起大鼠反轉學習能力受損

采用T-迷宮檢測大鼠反轉學習記憶能力（圖1 A）。前6 d，將食物固定于T-迷宮的左側臂，隨著訓練的天數(shù)增加，大鼠在T-迷宮中選擇正確率亦逐漸增加；第6天，兩組動物選擇的正確率均達到80%（圖1 B）；隨后，檢測大鼠反轉學習記憶能力，在眶額葉皮層給藥后，大鼠在反轉學習過程中選擇正確率顯著低于對照組動物（圖1 B），表明丙泊酚可作用于眶額葉皮層損害大鼠的反轉學習記憶能力。

2.2 對大鼠運動、探索動機和情緒行為無明顯效應

反轉學習也可能受到非特異性因素的干預，如情緒和探索動機。眶額葉皮層微注射丙泊酚對大鼠在開場中的運動距離和站立次數(shù)無明顯效應（圖2 A至圖2 C），表明丙泊酚在眶額葉皮層并不影響大鼠的運動功能和探索行為。同時，眶額葉皮層給予丙泊酚不影響大鼠進入開場中心區(qū)域的次數(shù)和運動距離（圖2 D至圖2 E），表明大鼠的焦慮情緒行為未受到影響。

圖1 眶額葉皮層微注射丙泊酚對大鼠反轉學習記憶能力的損害

圖2 眶額葉皮層微注射丙泊酚對大鼠在開場中的運動距離和站立次數(shù)影響

2.3 可降低眶額葉皮層神經(jīng)元的興奮性

采用免疫組化檢測c-fos蛋白表達，分析給藥后眶額葉皮層神經(jīng)元興奮性的變化。給藥后眶額葉皮層熒光信號較弱，且c-fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少（圖3），表明丙泊酚可直接抑制眶額葉皮層神經(jīng)元的興奮性。

圖3 各組動物眶額葉皮層c-fos免疫組化染色結果（免疫組織化學熒光染色，×200）

3 討論

丙泊酚麻醉導致覺醒不能維持，表現(xiàn)為認知功能嚴重下調。在眶額葉局部微注射丙泊酚引起大鼠在T-迷宮中的正確選擇率嚴重下降；開場實驗中，眶額葉皮層微注射丙泊酚對大鼠的運動、情緒和探索動機無明顯效應，可引起c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)量減少。結果表明，丙泊酚可直接抑制眶額葉皮層興奮性，引起警覺及認知功能下調。

眶額葉皮層主要接受體感皮層、背縫核、邊緣皮層和海馬的輸入，主要投射至前額葉和腹側被蓋區(qū)［19-21］。靈長類動物中，損毀眶額葉皮層動物在學習記憶任務中選擇的錯誤次數(shù)增多。嚙齒類動物中，抑制或損毀眶額葉皮層可造成反轉學習記憶或認知的靈活性受損［13，22］。反轉學習與眶額葉皮層神經(jīng)元放電編碼模式和神經(jīng)元集群網(wǎng)絡振蕩密切相關。采用多通道記錄技術監(jiān)測眶額葉皮層神經(jīng)元的放電，發(fā)現(xiàn)在反轉學習過程中，眶額葉皮層神經(jīng)元放電能表征環(huán)境信號所預測的結果［23-24］。通過c-fos標記技術發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可能是通過下調眶額葉皮層的神經(jīng)元興奮，抑制神經(jīng)元的特定編碼模式，進而造成反轉學習功能受損。

在新皮層及皮層下區(qū)域，丙泊酚可直接作用于神經(jīng)元的胞體，增強神經(jīng)元的鉀通道或抑制超極化激活非選擇性陽離子通道，產(chǎn)生外向電流，導致神經(jīng)元發(fā)生超極化，引起興奮性下降。丙泊酚同時可增強GABAA型受體介導的抑制性輸入，間接地抑制神經(jīng)元活動［12，18，25-27］。但本研究側重于行為學和形態(tài)學的觀察，丙泊酚調控眶額葉皮層的離子通道機制尚不清楚，還需進一步研究。

丙泊酚作為常用麻醉藥物，具有起效快、蘇醒快的特點，其麻醉的顯著特征為認知功能下調［4-5］。丙泊酚可直接作用于眶額葉皮層，通過抑制該腦區(qū)活動進而下調學習記憶功能，表明眶額葉皮層是丙泊酚發(fā)揮麻醉效應重要的靶區(qū)。