轉鐵蛋白受體靶向多肽載體合成條件的優化*

李松濤，趙紅玲，常安琪，祁 麟

（承德醫學院中藥研究所/河北省中藥研究與開發重點實驗室，河北承德 067000）

研究表明，轉鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）在一些腫瘤細胞表面呈現過表達現象，而在正常細胞表達量很低[1-2]，這種差異化表達提示TfR可能成為腫瘤治療的作用靶點。噬菌體展示技術是篩選腫瘤靶向多肽的主要方法之一[3]。DAI等[4]利用噬菌體展示技術篩選到一條對TfR具有高親和力的多肽BP9，隨后他們又制備了一種BP9氮末端連接麻風樹毒蛋白的融合蛋白，并發現該融合蛋白對肝癌細胞具有顯著的增殖抑制活性，而對正常肝細胞沒有影響[5]，這一結果提示BP9可能成為腫瘤細胞靶向給藥的載體。

本課題組前期研究設計并合成了一種BP9氮末端連接半胱氨酸的類似物BP9a，通過引入活性反應基團巰基實現BP9的靶向載體功能。本文進一步對BP9a固相合成條件中的縮合體系和裂解試劑進行優化，以期提高BP9a粗肽的純度和收率，并為腫瘤細胞靶向多肽的規模化制備提供依據。

1 儀器、試劑與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器：U3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；Heal Force純水機（香港力康公司）；TDL-40B型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；AR224CN型分析天平（美國奧豪斯儀器上海有限公司）；DF-101S型加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.1.2 試劑：2-CTC樹脂（天津南開合成科技有限公司，取代度1.3mmol/g）；Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH（成都誠諾新科技有限公司）；O-苯并三氮唑-N, N, N", N"-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）、1-羥基苯并三唑（HOBt）（蘇州中科天馬肽工程中心有限公司）；N, N"-二異丙基碳二亞胺（DIC）、N,N"-二異丙基乙胺（DIPEA）（蘇州昊帆生物科技有限公司）；三氟乙酸（TFA，百靈威科技有限公司）；苯甲醚（Anisole）、苯甲硫醚（Thioanisole）（上海晶純試劑有限公司）；1，2-乙二硫醇（EDT）（美國Amresco公司）；三異丙基硅烷（TIS，上海邦成化工有限公司）；苯酚（Phenol）、N，N"-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、哌啶、乙醚等均為市售分析純試劑；甲醇和乙腈為市售色譜純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 BP9a全保護肽樹脂的制備：以2-CTC樹脂為固相載體，DIC/HOBt或HBTU/DIPEA為縮合體系，應用Fmoc/tBu交叉保護策略，按照多肽固相合成法[6]合成BP9a全保護肽樹脂。

稱取2-CTC樹脂（1g，1.2mmol）用DMF溶漲、洗滌，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH（1.38g，3.6mmol）、DIPEA（0.72 ml，3.6mmol），室溫反應1h后抽掉反應液，DMF洗滌樹脂，得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC樹脂。加入30ml封閉液（DCM：甲醇：DIPEA=80:15:5，V:V）封閉2次，每次10min，抽干封閉液，DMF洗滌樹脂。向上述Fmoc-Ser(tBu)-CTC樹脂中加入含20%哌啶的DMF溶液脫除Fmoc保護基團，再加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH（2.33g，3.6mmol）和縮合試劑，室溫反應一定0.7～1.5 h，抽掉反應液，DMF洗滌樹脂。按照BP9a的肽序列，重復上述脫Fmoc保護與氨基酸偶聯步驟，依次連接Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH，脫除N末端Cys的Fmoc保護基后，肽樹脂經甲醇（20 ml）收縮兩次，每次10min，真空減壓干燥至恒重，得BP9a肽樹脂。

1.2.2 裂解與沉降：稱取“1.2.1”中的BP9a全保護肽樹脂0.1g，加入1ml裂解試劑，0℃反應30min后再升至室溫反應2h，濾除樹脂，用少量TFA洗滌樹脂，合并濾液并緩慢加入到10倍于濾液體積的冰乙醚沉降，離心后棄去上清液，將沉淀用冰乙醚洗滌三次，真空減壓干燥至恒重，得BP9a粗品。

1.2.3 粗肽純度分析：HPLC分析條件：Innoval C18色譜柱（4.6mm×250mm，5 m）；流動相：A，0.1% TFA/水；B，0.1%TFA/乙腈，洗脫梯度（0→20min：B 5%→95%）；流速：1ml/min；檢測波長215nm；柱溫30℃。

2 結果與分析

2.1 縮合體系的優化 HBTU/DIPEA和DIC/HOBt是固相多肽合成中常用的兩種縮合體系，且前者偶聯氨基酸的效率通常要高于后者。本研究在BP9a全保護肽樹脂合成過程中分別使用HBTU/DIPEA和DIC/HOBt兩種縮合體系偶聯氨基酸，通過比較上述兩種縮合體系對氨基酸偶聯時間、合成完畢后得到肽樹脂的增重量及肽樹脂裂解后所得粗肽純度的影響，以確定所使用的縮合體系。結果見表1：DIC/HOBt縮合體系偶聯氨基酸的反應時間比HBTU/DIPEA縮合體系長，但使用DIC/HOBt作為縮合體系得到的BP9a肽樹脂的增重量與肽樹脂經裂解后得到的粗肽純度均高于后者，較高的粗肽純度可以簡化后續的純化過程，更有利于得到高純度、高收率的精肽，因此本研究選擇DIC/HOBt縮合體系作為氨基酸的偶聯試劑。

表1 兩種縮合體系比較

2.2 裂解體系優化 在固相多肽合成過程中，肽樹脂的裂解是重要步驟之一，直接影響精肽的純度和收率。Fmoc/tBu保護策略的多肽固相合成，切肽和脫除側鏈保護基時可采用弱酸。TFA為應用最廣泛的弱酸試劑，它可以脫除t-Bu、Boc等側鏈保護基團，且條件溫和、副反應較少。BP9a肽樹脂合成過程中所使用的氨基酸側鏈保護基團有tBu、Pbf和Trt，針對這些保護基團，本研究考察了5種常用的裂解試劑切肽后對粗肽純度的影響。稱取BP9a肽樹脂0.1g，加入相應裂解試劑各1ml，按1.2.2的裂解與沉降操作得到相應的粗肽并稱重，按照1.2.3的HPLC分析方法測定5種裂解條件下得到粗肽的純度，根據公式計算各個裂解條件下得到粗肽的相對收率。5種裂解試劑對BP9a粗肽純度和相對收率的影響結果見表2，配比為TFA: EDT : H2O : TIS ( 94: 2.5: 2.5: 1, V : V ) 的裂解試劑切肽后得到BP9a粗肽的純度和收率最高。因此，配比為TFA: EDT : H2O : TIS ( 94: 2.5: 2.5: 1, V : V ) 的裂解試劑組合最適合本文BP9a肽樹脂的裂解反應。

表2 不同裂解試劑的比較

3 小結

本文對腫瘤細胞轉鐵蛋白受體靶向多肽類似物BP9a的固相合成條件進行了優化。優化后的縮合體系和裂解試劑組合分別為DIC/HOBt和TFA:EDT:H2O:TIS(94:2.5:2.5:1, V:V)，在上述優化的合成條件下得到粗肽的純度和相對收率均最高。本研究可為腫瘤細胞靶向多肽載體的規模化制備提供借鑒。