何首烏飲對衰老生精細胞p53、Bcl-2和Bax mRNA表達的影響*

單博穎，薛亞然，梁 思，張 研，齊 峰，牛嗣云△

（1.河北大學醫學院，河北保定 071000；2.河北大學附屬醫院；3.保定市第一醫院）

細胞凋亡在睪丸細胞的分化、精子的成熟及存活中發揮重要作用[1]。研究顯示，生精細胞異常凋亡會引發男性不育癥等[2]。中藥復方在治療男性不育癥和延緩衰老方面發揮著重要作用。本課題組前期研究發現[3]，何首烏飲能降低睪丸組織細胞凋亡率，并且能通過提高睪丸間質細胞睪酮合成酶的活性促進睪酮分泌，改善自然衰老大鼠精子的質量。為進一步明確何首烏飲減少大鼠生精細胞凋亡的調控機制，本研究觀察了何首烏飲對衰老生精細胞凋亡相關基因p53、Bcl-2和Bax mRNA表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥物制備 實驗動物為清潔級雄性Wistar大鼠，購自河北醫科大學動物實驗中心（動物許可證號1510063）。

何首烏飲方藥的組成：取何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊霍、丹參、茯苓，按質量比為3：2：3：2：5：3混合。選用北京康仁堂藥業有限公司生產的中藥顆粒配成何首烏飲中藥顆粒劑。飲片與顆粒的當量比，制何首烏1：10，肉蓯蓉1：10，懷牛膝1：5，炙淫羊藿1：20，丹參1：10，茯苓1：5。

何首烏飲給藥劑量：生藥4.8g/100g作為給藥量。根據北京康仁堂藥業有限公司生產的配方顆粒的飲片與顆粒當量比換算，大鼠給藥量為0.56g/100g（將0.56g顆粒溶于0.8ml生理鹽水中灌胃，含藥量0.7g/ml）。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養基，美國Gibcos公司；特級胎牛血清，以色列Biological Industries公司；膠原酶IV，美國Sigma公司；Trizol Reagent，美國Ambion公司；PrimeScript RT reagent Κit with Gdna Eraser、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus），日本TaΚaRa公司。安捷倫Mx 3000P熒光定量PCR儀，美國AgiLent techno-Logies公司；全波長酶標儀，美國BioTek Epoch公司；二氧化碳培養箱，美國Thermo Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 含藥血清的制備：Wistar大鼠15只，體重320～360g，何首烏飲灌胃給藥，每天2次，連續7天。第7天給藥1小時后，以6%水合氯醛麻醉大鼠，自內眥取血，分離血清，過濾后無菌分裝，-80℃冷凍保存。

1.3.2 采用生精細胞和支持細胞共培養的方法培養生精細胞[4]：

⑴支持細胞：雄性大鼠出生后第15～20天取出雙側睪丸[5]，使用IV型膠原酶和胰蛋白酶消化使曲精小管斷裂，然后培養在含10% FBS的DMEM/F12培養液中，置于34℃、5%二氧化碳培養箱中培養4小時，待細胞混懸液中的間質細胞基本貼壁后轉移上清液至另一新的培養瓶中，于34℃、5%二氧化碳培養箱中繼續培養至3天。采用蘇丹IV染色進行鑒定。

⑵精原干細胞：雄性大鼠出生后第7～9天取出雙側睪丸[6]，采用兩步酶消化法從睪丸組織中初步分離精原干細胞，差異貼壁法進一步純化后，培養在含15% FBS的DMEM/F12培養液中，置于34℃、5%二氧化碳培養箱中培養3小時，待大部分間質細胞及成纖維細胞貼壁后，轉移上清液至另一離心管中計數，以5×105～7×105個/ml接種于支持細胞中。上述支持細胞培養第5天時，胰酶消化細胞，收集消化下來的細胞，調整細密度為2×105～3×105個/ml接種在六孔板中，48小時后接種精原干細胞，接種后繼續培養7天。采用堿性磷酸酶染色和HE染色進行鑒定。

1.3.3 衰老細胞模型的建立：采用自由基氧化損傷法[7]建立生精細胞衰老模型。將培養7天的生精細胞中直接加入終濃度為50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4，繼續培養8小時，更換新鮮培養液，繼續培養3天，以建立衰老模型。采用β-半乳糖甘酶染色進行鑒定。

1.3.4 細胞分組：生精細胞分為3組：①正常組（NG組），培養7天的生精細胞，繼續培養80小時。②衰老組（AG組），按照1.3.3的方法建立衰老模型。③何首烏飲組（SWYG組），按照1.3.3的方法建立生精細胞衰老模型后，加入終濃度為10%的何首烏飲含藥血清，繼續培養3天。

1.3.5 實時熒光定量PCR法檢測生精細胞Bcl-2、Bax和p53 mRNA的表達：由Invitrogen公司設計合成Bcl-2、Bax和p53基因的引物序列（附表）。用Trizol法提取生精細胞的總RNA，酶標儀檢測濃度。使用反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄得cDNA，按照試劑盒操作進行PCR反應，條件為：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 31s，擴增40個循環。運用2-△△Ct方法分析實驗結果。

附表 各基因引物序列及產物大小

1.4 統計分析 采用SPSS 19.0軟件分析實驗數據，P＜0.05為差異有統計學意義。首先進行正態性檢驗，符合正態分布的計量數據用（±s）表示，使用單因素方差分析比較組間差異，若方差齊，兩兩比較采用最小顯著差法（least significant difference，LSD），如果方差不齊則采用Dunnett’s T3檢驗進行兩兩比較。計數資料用百分率（%）表示，采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 支持細胞和生精細胞的鑒定 支持細胞培養5天連接成片，密集生長（圖1A）。精原干細胞與支持細胞共培養2天后，精原干細胞附著于支持細胞表面，精原干細胞呈圓形或卵圓形（圖1B）；共培養7天后，精原干細胞分裂增殖，可見各級生精細胞（圖1C）。

蘇丹IV染色結果，支持細胞胞質中可見染成橘紅色的脂滴，支持細胞純度可達90%以上（圖1D）。HE染色可見成簇存在且著色為紫紅色的圓形細胞為各級生精細胞，淡紫色且呈不規則形狀的是支持細胞（圖1E）。堿性磷酸酶染色，可見精原細胞膜及細胞質內灰黑色顆粒，精子細胞弱陽性或不著色（圖1F），支持細胞不著色。

圖1 支持細胞和生精細胞的培養與鑒定（標尺=50 μm）

2.2 生精細胞衰老模型的鑒定 β-半乳糖苷酶染色陽性產物呈藍色，定位于細胞質（圖2A-B）。結果顯示衰老 組生精細胞陽性細胞率明顯高于正常組（P＜0.05，圖2C），衰老組β-半乳糖苷酶陽性細胞率可達80%以上。

圖2 生精細胞β-半乳糖苷酶染色結果（標尺=50μm）

2.3 何首烏飲對衰老生精細胞p53、Bcl-2、Bax mRNA表達的影響 AG組生精細胞p53和Bax mRNA的表達明顯高于NG組（P＜0.05），Bcl-2 mRNA的表達明顯低于NG組（P＜0.05）。何首烏飲干預后，生精細胞中p53和Bax mRNA的表達明顯低于AG組（P＜0.05），Bcl-2 mRNA的表達明顯高于AG組（P＜0.05）。Bax/Bcl-2比值AG組明顯高于NG組（P＜0.05），何首烏飲干預后，該比值明星低于AG組（P＜0.05）。見圖3-4：

圖3 各組生精細胞p53、Bcl-2和Bax mRNA的表達情況

圖4 各組生精細胞Bax/Bcl-2比值

3 討論

中醫藥通過提高機體的抗氧化能力、提高免疫力、降血脂等多方面發揮抗衰老的作用，具有很好的臨床療效[8]。何首烏飲是由何首烏丸加味而成。何首烏丸是劉河間《宣明論》中的傳統臨床驗方，以何首烏為主藥，配以肉蓯蓉和懷牛膝，在此基礎上增加了淫羊藿、丹參、茯苓。前期研究證明，何首烏飲可以通過調控線粒體凋亡途徑中關鍵基因的表達，抑制睪丸生精細胞凋亡，改善生精功能，延緩睪丸組織退化[9]。

細胞過度凋亡是睪丸生殖功能降低的重要原因之一[10]。研究表明，p53是細胞生長周期中的負調控因子，與細胞周期的調控、DNA修復、細胞分化、細胞凋亡等重要的生物學功能有關[11]。p53基因在正常細胞中低表達，當細胞受到應激刺激時，可誘導細胞中p53高表達。p53的編碼產物可以調節Bax的表達，Bax可介導p53依賴的細胞凋亡；同時，p53可能通過下調Bcl-2的表達間接導致細胞凋亡[12]。Bax是一種促凋亡基因，能夠拮抗Bcl-2的抑制凋亡的作用。Bcl-2和Bax是一對正負凋亡調節基因，二者形成同源二聚體或異二聚體來促進細胞凋亡[13]。因此，Bax/Bcl-2比值對于決定細胞接受刺激信號后存活起著關鍵作用。如Bcl-2過量表達有利于細胞存活，如Bax過量表達，則細胞會發生凋亡。

何首烏飲屬于中藥復方，雖然所包含的化學成分并不十分清楚，但已有的研究表明，何首烏中的二苯乙烯苷、淫羊藿中的淫羊藿苷、丹參中的丹參酮IIA均可通過調控線粒體通路關鍵基因發揮抑制細胞凋亡的作用[14-16]。本研究結果提示，何首烏飲能夠抑制生精細胞p53和Bax mRNA的表達水平，提高Bcl-2 mRNA表達水平，從而延緩生精細胞衰老，抑制生精細胞凋亡，但還需其它實驗方法對本研究結果進行驗證。