高效液相色譜儀法檢測乳酸鏈球菌素含量的研究

胡小立 王淑霞 郭向陽 盧珊珊 霍 巍

雙匯集團(tuán)技術(shù)中心 河南漯河 462003

天然保鮮劑具有無毒、安全、價格合理、環(huán)保、抗菌性強等特點，天然保鮮劑的開發(fā)研究深受科學(xué)家的重視。乳酸鏈球菌素是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種天然食品防腐劑，乳酸鏈球菌素(Nisin)是由三十多個氨基酸殘基組成的多肽，可抑制肉毒梭菌、單增李斯特菌屬和大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌，并對芽孢桿菌的孢子有強烈的抑制作用[1～6]，乳酸鏈球菌素通過降低腐敗菌細(xì)胞膜磷脂數(shù)量，抑制細(xì)胞膜孔道的形成，阻礙膜內(nèi)外的信息與能量傳遞，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制腐敗菌生長[7]。乳酸鏈球菌素食用后，在人體生理pH條件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不會改變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群，也不會產(chǎn)生如其它抗菌素所出現(xiàn)的抗性問題，更不會與其它抗菌素出現(xiàn)交叉抗性，因此對人體安全無毒副作用，是一種安全、綠色、環(huán)保的防腐劑[8～11]。乳酸鏈球菌素在GB2760[12]中僅規(guī)定了的最大使用量，最大使用量達(dá)0.5g/kg，可以廣泛應(yīng)用于乳及乳制品、預(yù)制肉制品、熟肉制品、蛋制品、復(fù)合調(diào)味料、飲料等食品行業(yè)，安全系數(shù)高。

市售乳酸鏈球菌素含量不一，含量決定乳酸鏈球菌素的效價，并且其熱穩(wěn)定性易受溫度、pH、基質(zhì)等影響，進(jìn)而在一定程度上限制了Nisin在食品熱加工中的應(yīng)用，影響最終抑菌效果[13]。最常用的測定方法是瓊脂擴散法和顯色法[14，15]，此兩種方法步驟繁瑣，檢測周期長，且受菌種活力、菌懸液濃度、培養(yǎng)基質(zhì)量等諸多因素的影響，檢測結(jié)果不穩(wěn)定，檢測誤差大的缺點，影響售賣價格。劉珈伶[16](2018)等建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)同時測定鮮濕米粉中乳酸鏈球菌素A(Nisin A)和乳酸鏈球菌素Z(Nisin Z)的分析方法，但檢測儀器成本高，通用性差，且只能檢測Nisin A、Nisin Z兩種類型，而已知的乳酸鏈球菌素共有6種類型[17，18]，無法準(zhǔn)確反映乳酸鏈球菌素整體含量。另外，孟茹[19](2013)等建立了酶聯(lián)免疫吸附法來檢測乳制品、肉制品和含乳飲料中的乳酸鏈球菌素的含量，但該法需要進(jìn)行免疫原、多克隆抗體的制備，其中多克隆抗體的制備需要動物免疫，直到獲得滿意的抗體效價為止，然后再采集抗血清，進(jìn)行純化后才能進(jìn)一步檢測，過程復(fù)雜，檢測成本高。

高效液相色譜法是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，是一種快速有效的有機化合物分析技術(shù)[20，21]，能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)物的有效分離分析，提高檢測精準(zhǔn)度，在環(huán)境監(jiān)測、衛(wèi)生防疫、石油化工、食品生產(chǎn)等行業(yè)廣泛應(yīng)用，檢測成本也在大部分企業(yè)接受能力范圍之內(nèi)。本試驗研究建立利用高效液相色譜儀快速檢測乳酸鏈球菌素含量的方法，降低檢測成本，提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜：配AgiLent色譜工作站、自動進(jìn)樣器、真空脫氣機、四元泵和紫外檢測器。

1.2 試劑與耗材

除非另有說明，試驗用水為液相專用純化水或娃哈哈純凈水。

1.2.1 試劑

三氟乙酸：分析純。

磷酸氫二鉀：分析純。

乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品：效價1026IU/mg，麥克林。

流動相(A：0.25%；磷酸氫二鉀溶液：稱取2.5g磷酸氫二鉀加水溶解，用三氟乙酸調(diào)pH值至2.1，轉(zhuǎn)移定容至1 000mL容量瓶中，搖勻備用；B：乙腈，色譜純)。

1.2.2 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(20mg/mL)

準(zhǔn)確稱取0.2000g(精確至0.0001g)乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用0.02mol/L鹽酸溶液超聲溶解5min，定容至刻度，混勻備用。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱:艾杰爾ASB-C18(4.6mm×250mm,5μm)。

流動相：A∶B=60∶40。

進(jìn)樣量：20μL。

檢測波長：220μm。

柱溫：室溫。

流速：0.5mL/min。

1.3.2 測定條件

按照1.3.1液相色譜檢測條件對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣液等體積進(jìn)樣測定，樣品中待測物含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)，如果含量超出標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行上機測定。

1.4 實驗步驟

1.4.1 樣品處理

稱取適量樣品于容量瓶中，用0.02mol/L鹽酸溶液超聲溶解5min，定容至25mL容量瓶中。混勻后用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液備用。

1.4.2 色譜柱選擇

色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟，對色譜柱的要求是：柱效高、選擇性好，分析速度快[22，23]等。正確選擇色譜柱能夠達(dá)到較好的分離效果，不同基質(zhì)的色譜柱對樣品的分離效果不同，實驗中需要根據(jù)目標(biāo)分析物性質(zhì)(如分子量大小、溶解度、Pka)、分離要求、儀器、成本等各方面要求選擇合適的色譜柱[24]。乳酸鏈球菌素分子量在3 500Da左右，屬于大分子類物質(zhì)，色譜柱的尺寸、顆粒形狀及粒徑、顆粒表面積、孔徑、封端技術(shù)等對其分離度有決定性影響，因此選擇實驗室常用XDB-C18、SB-C18、ASB-C18等色譜柱對乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離研究，以便找出合適的色譜柱。

1.4.3 流動相的選擇

流動相對組分具有很強的親和力，并且與固定相共同競爭組分，流動相的種類及配比直接影響到組分的分離[25]。其中緩沖鹽的種類、pH值和濃度直接影響緩沖鹽的離子強度，而流動相的離子強度對可解離化合物的色譜峰形具有顯著影響；有機溶劑的種類和配比決定流動相的極性，即洗脫能力，這對出峰時間、峰形、分離度等有著不可忽視的作用。因此需要對流動相組成選擇優(yōu)化。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

有研究發(fā)現(xiàn)[26，27]，經(jīng)過一些處理，如螯合劑處理、冷凍、高壓、降低pH值等，Nisin即可顯示出對沙門桿菌、假單胞桿菌、擬桿菌、放線桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌抗菌作用明顯增強。云雪霞[28](2006)等的研究也表明，EDTA作為螯合劑與Nisin聯(lián)合應(yīng)用，可明顯地抑菌大腸桿菌生長，且隨Nisin濃度增加和作用時間延長抑菌作用明顯增強，因此乳酸鏈球菌素成品基質(zhì)復(fù)雜，且考慮到其相互作用，標(biāo)準(zhǔn)品配置時濃度需要較高，將乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)儲備液用0.22μm微孔濾膜過濾，濾液用0.02mol/L鹽酸溶液稀釋至1、5、10、15、20mg/mL備用。

1.4.5 乳酸鏈球菌素效價按下式計算：

式中：

C測-標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的樣液中乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL)；

C稱-稱樣時樣液中乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度，單位為毫升毫克每毫升(mg/mL)；

注：效價單位為IU/mg，試樣中的乳酸鏈球菌素含量采用色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算。

計算結(jié)果扣除空白值，保留整數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱選擇與維護(hù)

經(jīng)過對比研究，ASB-C18色譜柱適用于低pH值，具有較高極性，無封端，耐酸性好，對乳酸鏈球菌素分離柱效高、選擇性好,分析速度快，因此選擇ASB-C18色譜柱進(jìn)行乳酸鏈球菌素含量的研究。液相色譜柱的價格相對較貴，平均使用壽命為6～12個月。隨著使用時間增長、進(jìn)樣次數(shù)的增加，往往會出現(xiàn)色譜柱柱效降低的想象，如色譜峰峰高降低、峰寬增寬、分離效果降低、峰形不流暢的情況，甚至出現(xiàn)裂峰、肩峰、拖尾峰等情況[29]，給日常的分析工作帶來一定的困難。因此為提高色譜柱的使用壽命，降低成本，需要做好色譜柱的日常維護(hù)工作[30]：分析實驗前，用10～20倍柱體積的流動相平衡色譜柱；最好使用流動相來溶解樣品；實驗結(jié)束用合適的容積進(jìn)行充分清洗，同時按照色譜柱使用說明書中指明的溶劑來填充色譜柱，并用柱頭將色譜柱兩端擰緊。

2.2 流動相的選擇

為考察不同酸對乳酸鏈球菌素在C18柱上保留行為的影響，分別利用甲酸、乙酸、鹽酸、三氟乙酸對流動相A調(diào)pH值至2左右進(jìn)行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸、乙酸、鹽酸等分離效果差，甚至無法分離，三氟乙酸調(diào)pH值后分離效果較好；為選擇最佳洗脫條件，分別選擇甲醇水、乙腈水、磷酸氫二銨與乙腈洗脫體系，設(shè)置不同的洗脫程序進(jìn)行試驗，最終表明流動相A和B體積比為60∶40時，乳酸鏈球菌素目標(biāo)峰出峰穩(wěn)定，峰形好，且與雜質(zhì)峰分離度好；本實驗還考察溫度、流速對乳酸鏈球菌素保留行為的影響，溫度對乳酸鏈球菌素的保留時間影響差別不明顯，但流速對保留時間影響較大，流速快，目標(biāo)峰保留時間靠前，無法與雜質(zhì)峰分開。綜上所述，選擇三氟乙酸進(jìn)行pH值調(diào)節(jié)，流動相A與B等梯度洗脫(體積比60∶40)，流速0.5mL/min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以儀器峰面積Y對乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度x(mg/mL)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1)。其回歸方程為Y=340.118973x+35.202113，相關(guān)系數(shù)r2=0.99973，說明在乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度為1～20mg/mL范圍內(nèi)，乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

圖1 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 StandardCurve of Nisin

2.4 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品色譜圖

等度洗脫條件下(磷酸氫二鉀溶液與乙腈比例為60∶40)，乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品、樣品色譜圖分別如圖2和圖3，由圖可知：乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)峰能和雜質(zhì)峰區(qū)分開，可以進(jìn)行準(zhǔn)確積分計算含量。

圖2 乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig. 2 Chromatogram of Standard Substance of Nisin

圖3 乳酸鏈球菌素樣品色譜圖Fig. 3 Chromatogram of Sample of Nisin

2.5 方法回收率及檢出限

在乳酸鏈球菌素樣品中添加乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品，計算其加標(biāo)回收率、RSD值及檢出限。由表1結(jié)果可知：樣品加標(biāo)回收率達(dá)90%以上，其RSD值小于5%，以3倍信噪比計算檢出限為0.5mg/mL。具體檢測數(shù)據(jù)見表1。

表1 樣品加標(biāo)回收率及RSD值

2.6 穩(wěn)定性研究

同批次上機檢測樣品穩(wěn)定性較好(如表2)，檢測值RSD均小于5%，但因乳酸鏈球菌素溶解度受pH、樣品基質(zhì)等因素影響，樣品保留時間稍有差異。

究其原因為乳酸鏈球菌素應(yīng)用到食品當(dāng)中時，由于能與食物中一些組分相互作用，其抗菌活性會大大降低。

張子杰[31〗(2014)研究發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素本身可以和許多活性物質(zhì)聯(lián)合作用，發(fā)揮協(xié)同效應(yīng),克服抗菌譜窄的不足；杜琨[32](2018)以金黃色葡萄球菌為指示菌，研究發(fā)現(xiàn)氯化鈉、乙醇和蛋白酶K對乳酸鏈球菌素的活性有增強作用，食品中的酪蛋白、卵磷脂和木瓜蛋白酶則對乳酸鏈球菌素的活性有負(fù)面影響，而胃蛋白酶和胰腺蛋白酶對乳酸鏈球菌素的活性沒有顯著影響；熊玲[33](2012)等研究發(fā)現(xiàn)磷酸鹽、EDTA二鈉、檸檬酸鈉對Nisin的抑菌活性保護(hù)作用較顯著。

綜合考慮乳酸鏈球菌素基體成分對其活性的影響，本文計算效價時，乳酸鏈球菌素活性按百分之百計算。

表2 乳酸鏈球菌素穩(wěn)定性研究

2.7 準(zhǔn)確性研究

利用瓊脂分散法檢測Nisin的效價是由英國Aplin&Barrett公司的Tramer,J.&Fowler,G.G1964[14]在學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表的，該方法成為國際公認(rèn)的Nisin效價檢測法。本實驗檢測值通過與國標(biāo)瓊脂分散法[34](GB1886.231-2016)檢測值對比，可看出其準(zhǔn)確度可靠，與國標(biāo)法檢測值誤差小于10%，說明此方法可用于乳酸鏈球菌素含量的檢測，具體數(shù)值見表3。

表3 乳酸鏈球菌素效價液相法與國標(biāo)法對比

3 結(jié)論

(1)乳酸鏈球菌素純度低，需要稱樣量較大才能達(dá)到檢測限，若能對其進(jìn)行進(jìn)一步純化，可大大提高檢出限，使其應(yīng)用于乳酸鏈球菌素含量低的樣品檢測。乳酸鏈球菌素的提取純化主要有有機溶劑法、吸附法和柱層析法：李健武[35](2000)等利用正丙醇、丙酮、乙酸等有機溶劑沉淀Nisin，再經(jīng)鹽析，反復(fù)沉淀、溶解的過程，是一種經(jīng)典方法，但其缺點是回收率低，回收產(chǎn)物活性低；吸附法[36]其一是利用乳酸菌對Nisin具有一定的吸附作用，再凈化，還有另一種吸附法是應(yīng)用一些吸附劑在合適條件下使其與Nisin吸附以達(dá)到提取純化的目的；柱層析法[37]則是傳統(tǒng)的層析方法-免疫親和層析的應(yīng)用。

(2)乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，其回歸方程為Y=340.118973x+35.202113，相關(guān)系數(shù)r2=0.99973，穩(wěn)定性較好(RSD<5%)，準(zhǔn)確度可信，樣品上機檢測只需要十幾分鐘即可，因此可以利用高效液相色譜儀法快速檢測乳酸鏈球菌素含量。

(3)乳酸鏈球菌素含量和效價成正相關(guān)，可以根據(jù)樣品含量計算出其對應(yīng)效價。此法前處理操作步驟簡單，所用儀器比較普遍，檢測成本低，能及時準(zhǔn)確的出具結(jié)果，是瓊脂分散法檢測效價的良好補充，或可取代瓊脂擴散法進(jìn)行效價的快速檢測。