多指標評價美拉德反應產物的抑菌性能

章銀良 李 鑫 蔡亞玲

1.鄭州輕工業學院 食品與生物工程學院 河南鄭州 450001 2.食品生產與安全河南省協同創新中心 河南鄭州 450001

隨著食品行業迅猛發展，一些食品安全問題浮出水面，怎樣有效防止食品腐敗變質成為食品企業首要解決的問題[1]。

在現代食品工業中最常使用的食品保鮮技術有低溫保鮮、氣調保鮮，涂膜保鮮和化學保鮮。其中化學保鮮是使用化學藥劑對食品進行處理來達到防止食品腐敗變質的目的，這些用于食品保鮮作用的化學制劑皆可稱之為防腐劑，食品防腐劑一般按照原料來源的不同可劃分為化學合成防腐劑和天然防腐劑兩種[2，3]。

為防止或減少食品腐敗、變色和風味惡化，在食品中常使用人工合成防腐劑(如山梨酸鉀、苯甲酸鈉等)，其使用有一定的限量，并且化學合成抗菌防腐劑均有一定的毒副作用[4]，因此對合成防腐劑的擔憂使得人們去尋找能發揮同樣作用的替代品。美拉德反應在食品加工和儲藏過程中是自然發生的一類非酶褐變反應[5]，由于其MRPs中含有大量的具有抑菌活性的物質[6]，所以將其應用在食品中替代一些合成防腐劑成為日后研究工作的重點。

隨著人們安全意識不斷提高，天然防腐劑受到國內外的關注，Einarsson[7](1983)等人曾發現美拉德產物的抑菌效果與微生物的種類有關。因此，本文通過對L-賴氨酸和D-果糖MRPs、L-精氨酸和D-葡萄糖MRPs進行抑菌試驗來探索其對多種菌生長狀況的影響，研究其是否能夠抑制不同種菌的生長，為開發營養健康并具有獨特MRPs風味的食品提供了一定的理論依據和試驗數據，以期為延長食品的貨架期提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-賴氨酸、D-果糖、L-精氨酸、D-葡萄糖：Solarbio試劑公司。

生化試劑，蛋白胨、氯化鈉、酵母粉、瓊脂:北京奧博星生物技術有限公司。

無水乙醇，分析純，國藥集團有限公司。

去離子水。

1.1.1 指示菌

枯草芽孢桿菌(BNCC188080 Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Trans·T1、Top10、BL21)、酵母菌(MQ3-23、MQ3-11、MQ1-23、MQ3-21、MQ3-18、MQ2-6)、釀酒酵母(ACCC20032 Saccharomyces carlsbergensis)，11種受試菌株來自于本實驗室保藏。

菌懸液：細菌在37℃下搖床培養約2h和真菌在28℃下搖床培養約4.5h得到的濃度為(1.0～5.0)106CFU/mL菌液[8]。

1.1.2 指示菌培養基

YPD培養基：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%，瓊脂2%。

LB培養基：Nacl 1%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%，瓊脂1.5%～2%。

1.2 儀器與設備

牛津杯(內徑6.0mm，外徑8.0mm，高10.0mm)；檢測專用培養皿(內徑90mm，高15mm)；美國Rainin瑞寧Pipet-Lite XLS移液槍：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；YZJ-SCT121超凈工作臺：東莞市華旗凈化工程有限公司；SQP電子天平：賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；DNP-9162BS電熱恒溫培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；HJ-3恒溫磁力加熱攪拌器：常州國華電器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：廣州越特科學儀器有限公司；pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HH-1智能型數顯恒溫油浴槽：鞏義市予華儀器有限責任公司；101-2電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；DNP-9162BS恒溫震蕩培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 抑菌效果最佳的MRPs制備

依據前期均勻試驗中優化得出的制備MRPs的最佳反應條件。準確稱取D-葡萄糖3.6032g和L-精氨酸10.4520g(摩爾比1∶3)，溶解于90mL的去離子水中，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌至溶液清澈，再用3mol/L的HCl和3mol/L的NaOH調整溶液pH值至12.0，最后用事先調好的pH值為12.0的溶液定容到100mL，混合均勻后，取10mL反應液轉移到25mL具塞試管中，密封嚴實后，置于120℃恒溫油浴鍋中反應210min。反應結束后置于冰水中冷卻。再準確稱取D-果糖10.8096g和L-賴氨酸2.9238g(摩爾比3∶1)溶解于90mL的去離子水中，制備條件為加熱時間90min、反應初始pH值調至10.0、溫度120℃，余下制備步驟同上。

1.3.2 MRPs抑菌效果的研究

1.3.2.1 牛津杯法測定抑菌活性

按照Huang TH(2012)[9]、李冬梅[10](2006)等的方法稍作改動，在無菌條件下，將經過高壓蒸汽滅菌的固體培養基(酵母用YPD培養基，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌用LB培養基)冷卻溫度至40～45℃之間，倒平板。取200μL濃度為(1.0～5.0)×106CFU/mL的菌液轉移至固體培養基平板表面并涂布均勻，將涂布棒灼燒殺菌然后冷卻，用于均勻涂布菌液。用經滅菌的鑷子夾取已滅菌的牛津杯擺放于中央，用移液槍吸取200μLMRPs加入牛津杯內(細菌加入果糖和賴氨酸MRPs，酵母菌加入葡萄糖和精氨酸MRPs)，同時做試劑空白和陽性對照。酵母陽性對照試劑用乳酸，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌用氯霉素，放入恒溫培養箱中培養。測量抑菌圈直徑，并計算3次平行試驗的平均值。

1.3.2.2 菌落總數的測定

參考GB4789.2-2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》進行。用100μL微量移液槍分別吸取培養好的菌液100μL，沿管壁緩慢注于盛有900μL稀釋液的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管使其混合均勻,制成1∶10的樣品菌液。然后按照以上步驟制備10倍系列稀釋菌液。每種菌液分別得到以下七個濃度梯度：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。之后通過預試驗選擇適宜稀釋度(酵母菌稀釋10-4、細菌稀釋10-5)的菌液，分別吸取40μL菌液和200μLMRPs(細菌加入果糖和賴氨酸MRPs，酵母菌加入葡萄糖和精氨酸MRPs)混合后加入兩個培養基，用涂布棒涂布均勻。同時取40μL菌液分別加入另兩個培養基，涂布均勻作陰性對照。再分別取200μLMRPs加入兩個無菌培養基作空白對照。涂布結束后，將平板翻轉，細菌移至37℃恒溫培養箱培養12h，酵母菌移至28℃恒溫培養箱培養36h。培養完成后，觀察菌的生長情況，進行菌落計數。

1.3.2.3 抑菌率的測定

參照黃國文[11](2017)、雷歡[12](2017)等的方法。取100mL液體培養基和100mL混合液體培養基(10mL MRPs+90mL液體培養基)分別作為A1、A2的空白對照組。然后用紫外分光光度計分別測試其吸光度(酵母菌培養液在560nm處測量，細菌培養液在600nm處測量)，并記錄。取22支試管分成兩組(各11只)，第一組每管加入5mL含有MRPs的液體培養基和40μL菌液，第二組每管加入5mL液體培養基與40μL菌液，分別貼上標簽，塞上塞子用報紙包裹，放入恒溫震蕩培養箱里細菌37℃培養4h，酵母菌28℃培養8h，培養完成后分別用紫外分光光度計測量其吸光度，每對試管做3組平行(細菌組加入果糖和賴氨酸MRPs，酵母菌組加入葡萄糖和精氨酸MRPs)。

抑菌率計算公式如下：

抑菌率=(A1-A2)/A1

式中：

A1為不加MRPs組培養菌液的吸光度；

A2為加入MRPs培養的菌液吸光度

1.3.2.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定

參照Anis Ben Hsouna[13](2011),Sweetie R.Kanatt[14](2008)等的方法。采用二倍連續稀釋法測定[15]MRPs的最小抑菌濃度。取10支無菌試管編號，每支試管各加入5mL的液體培養基。無菌移液槍吸取5mLMRPs至1號試管，混勻后從1號試管吸取5mL至2號試管，以此類推，直至9號試管(棄去5mL)，分別將MRPs稀釋2、4、8、16、32、64、128、256、512倍，除9號試管外各加入40μL制備好的菌懸液，9號作為陰性對照，10號作為陽性對照。搖床培養后，從每支試管各吸取40μL至營養瓊脂培養基表面，并用無菌涂布棒涂布均勻，每支試管做3個平行。上述操作完畢后，將所有平板放置于(細菌37℃，真菌28℃)恒溫培養箱中培養24h后，查看各平板內各菌落的生長情況，其中完全沒有菌生長的平板對應的最低稀釋濃度即為最小抑菌濃度(MIC)[16]。

2 結果與分析

2.1 MRPs對不同菌種的抑菌活性的比較

2.1.1 牛津杯法測定抑菌活性

以抑菌圈直徑為測試指標，美拉德反應產物對不同菌種的抑制效果分別用SPSS 19.0軟件處理數據，試驗結果如表1和表2所示。

表1 MRPs對不同真菌的抑菌作用

如表1所示，通過方差分析和多重比較，得出葡萄糖和精氨酸MRPs對所測酵母菌均有不同程度的抑制，抑菌作用從大到小為MQ1-23>MQ3-18>MQ3-21>釀酒酵母>MQ3-11>MQ3-23>MQ2-6，其中對MQ1-23的抑制效果最好。因為牛津杯直徑為8mm，如果抑菌圈直徑小于8mm則代表無明顯的抑菌效果，所以從表2我們可以得出，果糖和賴氨酸MRPs對BL21抑制作用比較弱。同一濃度的MRPs對不同菌種的抑菌效果也不相同，其中抑菌作用從大到小為Trans·T1>TOP.10>枯草芽孢桿菌>BL21。

表2 MRPs對不同細菌的抑菌作用

注：1.表中“-”表示抑菌圈直徑≤8mm，無明顯抑菌作用。

2.同一行中，具有不同字母的表示差異顯著(p<0.05)，具有相同字母的表示差異不顯著(p>0.05)。

從試驗結果中可以看出美拉德反應產物對真菌和細菌均有一定的抑菌效果。其中葡萄糖精氨酸MRPs對MQ1-23酵母菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑為25.58±0.49mm；果糖賴氨酸MRPs對大腸桿菌Trans·T1的抑制作用最強，抑菌圈直徑為21.69±0.47mm。

2.1.1 菌落總數法測定結果分析

以菌落總數為指標，美拉德反應產物對不同菌種的抑制效果如圖1所示。

圖1 不同MRPs對細菌和真菌的抑菌作用Fig.1 The bacteriostatic effects to bacereia and fum juus from

從圖1中我們可以看到在加入美拉德反應產物后大腸桿菌Trans·T1從66減少到7，酵母菌MQ3-18從107減少到24，這兩種菌的菌落總數減少的幅度最大分別為89.39%和77.57%，酵母菌MQ1-23加入MRPs后菌落總數從79下降至19，減少幅度也很可觀為75.95%且僅次于MQ3-18位居第二。從圖1中我們還可以看出MRPs對這11種指示菌皆有不同程度的抑制作用，這與Einarsson[7](1983)等人曾提出的美拉德產物的抑菌效果與微生物的種類有關這一發現相符。

2.1.2 抑菌率法測定結果分析

以吸光度為指標，美拉德反應產物對不同菌種的抑制效果如圖2所示。

圖2 不同MRPs對細菌和真菌的抑制效果Fig.2 The bacteriostatic effests to bacreria and fum jus from differemt MRPs

由圖2可得不管是細菌還是真菌，抑菌培養完成后，不添加美拉德反應產物時菌液的吸光度均高于添加美拉德反應產物時菌液的吸光度，說明MRPs對這些菌的生長是有抑制作用的。從圖2中我們可以得出如下結論：美拉德反應產物對以上11種菌抑制強度存在差異，其中葡萄糖精氨酸對MQ2-6、MQ3-23、MQ3-11的抑菌率偏小，可能是因為在菌液培養的開始階段MRPs中未反應完全的葡萄糖促進了酵母菌的生長[17]。另外葡萄糖精氨酸MRPs對MQ1-23抑制作用最強，抑菌率為68.15%；果糖賴氨酸MRPs對大腸桿菌Trans·T1的抑制效果最好，抑菌率為78.60%。

2.1.3 最小抑菌濃度(MIC)法測定結果分析

按照1.3.2.4所述試驗方法及步驟，采用二倍連續稀釋法測定MRPs對11種常見腐敗菌的最小抑菌濃度(MIC)結果見表3。

如表3所示，MRPs對這11種指示菌均有不同程度的抑制作用。當MRPs濃度在稀釋16倍以下時，Trans·T1、TOP.10、枯草芽孢桿菌均不生長；當MRPs濃度在稀釋倍數在4倍以下時，BL21、MQ3-11、MQ3-23、MQ3-18、MQ3-21、釀酒酵母均不生長；其中抑制酵母菌MQ1-23所需MRPs最小抑菌濃度最小為稀釋倍數在32倍時。

表3 MRPs對供試菌的最小抑菌濃度

注：“—”表示無供試菌生長；“+”表示有供試菌生長；9號試管為陰性對照；10號試管為陽性對照。

3 結論

我們用抑菌圈、菌落總數、抑菌率、最小抑菌濃度四個指標來檢測MRPs對食物中常見細菌和真菌的抑制效果，并從4組數據中可以得出MRPs對大腸桿菌BL21的抑制效果比較弱，但對其它十種供試菌均有不同程度的抑制作用，并且綜合分析四個指標可以得出MRPs對酵母菌MQ1-23和大腸桿菌Trans·T1的抑制效果是最明顯的。此外，由最小抑菌濃度分析可知，隨著MRPs添加量的增大，抑菌作用會逐漸增強。因此可以考慮MRPs作為一種防腐劑添加入食品中，提高其抑菌能力、保持其感官特性并延長貨架期。