核酸檢測(cè)技術(shù)在無(wú)償獻(xiàn)血者血液篩查中的應(yīng)用

陶剛 李曉燕

[摘要] 目的 分析探討核酸技術(shù)在無(wú)償獻(xiàn)血者血液篩查中應(yīng)用的必要性。方法 方便選取該血站2017年6月—2018年6月共20 000人份標(biāo)本進(jìn)行研究，樣本檢驗(yàn)采用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)）法，對(duì)于ELISA單項(xiàng)陰性的標(biāo)本再進(jìn)行核酸檢測(cè)，觀察無(wú)償獻(xiàn)血者HbsAg、抗-HCV、抗-HIV檢測(cè)的陽(yáng)性率從而評(píng)價(jià)核酸檢測(cè)的價(jià)值。結(jié)果 經(jīng)過(guò)血清學(xué)ELISA檢測(cè)共260份陽(yáng)性樣本（1.31%），ELISA檢測(cè)陰性的標(biāo)本經(jīng)過(guò)核酸檢測(cè)有20例陽(yáng)性（0.10%）。結(jié)論 通過(guò)核酸檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血清學(xué)ELISA檢測(cè)合格的血液仍舊存在輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，主要是HBV（乙型肝炎），因此核酸檢測(cè)技術(shù)在獻(xiàn)血者血液篩查中的應(yīng)用能夠最大程度的防止輸血疾病的傳播，血液篩查的質(zhì)量明顯提升，提高了獻(xiàn)血的安全性。

[關(guān)鍵詞] 無(wú)償獻(xiàn)血；血液篩查；核酸檢測(cè)；應(yīng)用

[中圖分類(lèi)號(hào)] R19 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2019）01（b）-0183-03

[Abstract] Objective To analyze the necessity of application of nucleic acid technology in blood screening of unpaid blood donors. Methods A total of 20，000 specimens from June 2017 to June 2018 were convenient selected for the study. Samples were tested by ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay）. Nucleic acid detection was performed on ELISA single negative samples to observe unpaid blood donors. The positive rate of HbsAg， anti-HCV， and anti-HIV detection thus evaluates the value of nucleic acid detection. Results A total of 260 positive samples （1.31%） were detected by serological ELISA. The negative samples by ELISA were positive for 20 cases（0.10%） after nucleic acid detection. Conclusion The risk of transfusion-transmitted diseases is still found in the blood of serological ELISA test by nucleic acid test， mainly HBV （hepatitis B）. Therefore， the application of nucleic acid detection technology in blood screening of blood donors can prevent blood transfusion diseases to the greatest extent spreading， the quality of blood screening is significantly improved， and the safety of blood donation is improved.

[Key words] Unpaid blood donation； Blood screening； Nucleic acid detection； Application

臨床中預(yù)防和控制輸血相關(guān)的傳染病非常重要，現(xiàn)在我國(guó)供血機(jī)構(gòu)病毒血清學(xué)檢測(cè)模式為HbsAg、抗-HCV、抗-HIV聯(lián)合ELISA檢測(cè)，這種標(biāo)志物間接檢測(cè)雖然極大地降低了輸血疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，但是有較長(zhǎng)的“窗口期”， 從感染病原開(kāi)始至能夠某種檢測(cè)方法檢測(cè)到該病原存在的一段時(shí)間為“窗口期”[1-2]。試劑越來(lái)越優(yōu)化最大限度的縮短了“窗口期”仍存在免疫沉默性感染、病毒滴度、變異，輸血傳染病時(shí)有發(fā)生[3]。NAT為病毒核酸擴(kuò)增技術(shù)，現(xiàn)在不少發(fā)達(dá)國(guó)家將NAT運(yùn)用在獻(xiàn)血者血液篩查中，國(guó)內(nèi)少數(shù)血站初步應(yīng)用，為了進(jìn)一步分析NAT在血液篩查中的必要性，方便選取該站20 000份樣本進(jìn)行研究的具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取該血站共20 000人份標(biāo)本進(jìn)行研究，所有無(wú)償獻(xiàn)血者均資源參與此次研究并且簽署知情同意書(shū)，均符合《獻(xiàn)血者健康檢查的要求》[4]的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。20 000名無(wú)償獻(xiàn)血者中11 242人為男性，8 758人為女性，年齡18～50歲，平均（25.32±5.34）歲。采血需要使用3支EDTA抗凝管，血量5 mL，1600 r/min低溫離心15 min，放置2～8℃冰箱留樣，3支試管中2支帶分離膠，其中1支需要無(wú)熱源、無(wú)酶。分離血漿需要在24 h內(nèi)，48 h后血清學(xué)篩查只能用不帶分離膠的試管內(nèi)樣本，NAT檢測(cè)使用帶分離膠、無(wú)酶、無(wú)熱源的留樣試管，另外一管進(jìn)行標(biāo)本保存。

1.2 方法

所有血液樣本檢驗(yàn)采用兩種試劑進(jìn)行ELISA法檢測(cè)，任何一種試劑有反應(yīng)都需要進(jìn)行雙孔復(fù)查，對(duì)于其中任何一孔有反應(yīng)均判定為不合格。留取標(biāo)本當(dāng)天進(jìn)行ELISA檢測(cè)，第2天待查標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，所有操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。對(duì)于ELISA單項(xiàng)陰性的標(biāo)本再進(jìn)行核酸檢測(cè)，1份0.96 mL混樣池由6份原始樣本各160 μL匯集成，混樣不足6份的由加樣系統(tǒng)自動(dòng)補(bǔ)足0.96 mL，對(duì)混樣池進(jìn)行核酸提取，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)45個(gè)循環(huán)。所有操作均按照SOP操作規(guī)程進(jìn)行，核酸檢測(cè)技術(shù)結(jié)果報(bào)告：陰性結(jié)果混樣池的所有標(biāo)本報(bào)陰性結(jié)果，結(jié)果有反應(yīng)性混樣池需要進(jìn)行拆分檢測(cè)（原始樣本0.96 mL單樣本檢測(cè)），拆分的單樣本檢測(cè)有反應(yīng)報(bào)陽(yáng)性結(jié)果。

ELISA檢測(cè)試劑：HbsAg試劑生產(chǎn)廠家為北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司和廈門(mén)新創(chuàng)，抗-HCV生廠廠家為北京萬(wàn)泰和廈門(mén)新創(chuàng)，抗-HIV試劑生廠廠家為廈門(mén)新創(chuàng)和法國(guó)伯樂(lè)。所有試劑均為合格產(chǎn)品，通過(guò)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理部門(mén)批準(zhǔn)，使用嚴(yán)格遵循SOP的操作規(guī)程。核酸檢測(cè)試劑：華益美生產(chǎn)的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒（1型）核酸檢測(cè)試劑盒，采用PCR-熒光法使用儀器：全自動(dòng)酶免分析儀、全自動(dòng)酶免加樣儀（Tecan），全自動(dòng)核酸提取儀（華益美），全自動(dòng)擴(kuò)增分析儀（華益美）。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察無(wú)償獻(xiàn)血者HbsAg、抗-HCV、抗-HIV檢測(cè)的陽(yáng)性率并進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)核酸檢測(cè)的價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 所有標(biāo)本血清學(xué)ELISA檢測(cè)的結(jié)果

經(jīng)過(guò)血清學(xué)ELISA檢測(cè)共260份陰性標(biāo)本（1.31%），結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 所有標(biāo)本中血清學(xué)ELISA陰性樣本核酸檢測(cè)結(jié)果

ELISA檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本經(jīng)過(guò)核酸檢測(cè)有20份陽(yáng)性（10.10%），見(jiàn)表2。

3 討論

《血站技術(shù)操作規(guī)程》（2012版）規(guī)定將HBV、HCV、HIV核酸檢測(cè)方法納入到經(jīng)血傳播感染的檢測(cè)方法常規(guī)模式中，血液篩查中的核酸檢測(cè)技術(shù)主要包括兩種，一種為T(mén)MA，另一種為T(mén)aqman PCR技術(shù)[5]。TMA應(yīng)用較為廣泛，無(wú)償獻(xiàn)血者采用單人份核酸檢測(cè)技術(shù)后分析的靈敏度明顯提升，技術(shù)較為成熟和客觀。聯(lián)檢試劑HBV DNA達(dá)10.0 IU/mL，HCV RNA達(dá)3.0 IU/mL，HIV-1 RNA達(dá)45.0 IU/mL；鑒別試劑d-HBV達(dá)8.5 IU/mL，d-HCV達(dá)3.2 IU/mL，d-HIV-1達(dá)50.0 IU/mL[6]。

90年代，歐美一些發(fā)達(dá)國(guó)家開(kāi)始在獻(xiàn)血人群中使用核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)HBV、HCV和HIV進(jìn)行篩查，證明了可以有效降低血液疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，安全性較好[7]。但不同地區(qū)病毒流行率差異較為明顯，可受多種因素影響如檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量差異、ELISA試劑選擇差異、核酸檢測(cè)技術(shù)試劑或設(shè)備差異等[8]。通過(guò)此次研究得出結(jié)果：經(jīng)過(guò)血清學(xué)ELISA檢測(cè)共260份陽(yáng)性樣本（1.31%），ELISA檢測(cè)陰性的標(biāo)本經(jīng)過(guò)核酸檢測(cè)有20例陽(yáng)性（0.10%）。所采用的的核酸檢測(cè)技術(shù)篩查系統(tǒng)具有較高的林敏性，但是混合性樣品檢測(cè)的模式降低了系統(tǒng)本身的靈敏度導(dǎo)致核酸檢測(cè)技術(shù)篩查系統(tǒng)靈敏度高于混合檢測(cè)核酸檢測(cè)技術(shù)篩查系統(tǒng)靈敏度[9]。原因可能為核酸檢測(cè)技術(shù)可能存在較高假陽(yáng)性概率，也可能在取樣方面存在誤差[10]。核酸聯(lián)檢和鑒別試劑具有較高靈敏度，單項(xiàng)檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)本病毒分布不規(guī)則，在載量方面有缺陷，所有可能每次取量不同影響檢測(cè)的結(jié)果[11]。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，HbsAg血液篩查之后仍然存在傳播的主要因素是OBI（隱匿性乙型肝炎病毒）的獻(xiàn)血者的存在，OBI病毒無(wú)法有效檢出HbsAg但在核酸檢測(cè)技術(shù)中會(huì)呈現(xiàn)陽(yáng)性，說(shuō)明輸血的風(fēng)險(xiǎn)是發(fā)生OBI[12]。實(shí)際工作中ALT是無(wú)償獻(xiàn)血者獻(xiàn)血前的基本篩查項(xiàng)目，一般ALT不合格標(biāo)本會(huì)進(jìn)行報(bào)廢處理，其異常結(jié)果的原因不一定是HCV和HBV感染，也可能由其他病理性原因引起，因此實(shí)效性不理想[13]。

血清學(xué)的抗原抗體檢測(cè)具有較長(zhǎng)的窗口期，ELISA試劑檢測(cè)HbsAg的“窗口期”為56 d，抗-HCV為82天，抗-HIV為22 d，而NAT檢測(cè)HBV的“窗口期”縮短至25 d，HCV為59 d，HIV為11 d，明顯縮短了病毒的窗口期，有效檢測(cè)出ELISA漏檢的病毒早期感染的標(biāo)本[14]。我國(guó)是HBV感染概率較高的地區(qū)，雖然酶免試劑質(zhì)量提高降低了輸血后感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，但是ELISA“窗口期”的漏檢仍舊為影響血液安全性的關(guān)鍵，ELISA陰性的血液仍舊有可能漏檢導(dǎo)致輸血安全隱患，因此引進(jìn)NAT檢測(cè)確保輸血安全非常必要[15]。NAT技術(shù)是新型的輸血傳播傳染病因子的篩查方法，研究表明NAT可有效提升輸血安全系數(shù)，其反復(fù)性和靈敏度較為理想，WHO核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)稀釋之后HCV、HIV檢測(cè)結(jié)果顯示以100%標(biāo)準(zhǔn)檢出50 IU/mLHCV和50 IU/mLHIV-1的核酸，混合檢測(cè)單份血液檢測(cè)的靈敏度達(dá)到了95%。同時(shí)病毒核酸在血液標(biāo)本的采集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、檢測(cè)過(guò)程中不會(huì)降解，需要在4 h內(nèi)分離血漿、2～8℃保存、72 h內(nèi)完成檢測(cè)，若特殊情況無(wú)法完成檢測(cè)需要在-20℃環(huán)境下凍存，但是一份樣本僅可以進(jìn)行一次凍融，說(shuō)明外界因素不會(huì)影響檢測(cè)的結(jié)果。在規(guī)范性操作和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)中核酸檢測(cè)技術(shù)達(dá)到了臨床檢驗(yàn)技術(shù)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)的研究機(jī)構(gòu)做了一些血液殘余風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估發(fā)現(xiàn)NAT篩查得到的HBV結(jié)果各地不一，仍舊需要更多的數(shù)據(jù)積累，需要擴(kuò)大標(biāo)本檢測(cè)數(shù)量，為核酸檢測(cè)技術(shù)提供量化的、科學(xué)的證據(jù)。

綜上所述，通過(guò)核酸檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血清學(xué)ELISA檢測(cè)合格的血液仍舊存在輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，主要是HBV，因此核酸技術(shù)在獻(xiàn)血者血液篩查中的應(yīng)用能夠最大程度的防止輸血疾病的傳播，血液篩查的質(zhì)量明顯提升，提高了輸血的安全性。

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（收稿日期：2018-10-19）