肺炎支原體感染對支氣管哮喘病兒外周血1、9、17型輔助性T細胞及相關細胞因子水平的影響

程秀芳，陳俊松

支氣管哮喘為一種涉及多種炎性細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等)及介質的慢性氣道炎癥性疾病，氣道重塑及氣道高反應性為其基本病理特點[1-3]。由于小兒支氣管病理過程復雜，尚無明確發病機制，在輔助性T細胞1型(Th1)/輔助性T細胞2型(Th2)細胞之間的平衡失調導致Th2細胞占據主要地位被認為是最經典的哮喘病理機制理論，研究證實Th1、輔助性T細胞9型(Th9)、輔助性T細胞17型(Th17)及相關細胞因子在兒童支氣管哮喘病理過程中扮演重要角色[4-5]。肺炎支原體(MP)感染被認為是誘發哮喘的重要因素，有學者推測MP可特異性誘導免疫球蛋白IgE產生并與肥大細胞及嗜堿性細胞受體結合，使致敏的肥大細胞、嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放組胺、慢反應物質等炎性介質，而誘發或加重哮喘，因此MP感染與哮喘發作關系密切[6]。本研究主要分析MP感染對支氣管哮喘兒童外周血Th1、Th9、Th17及相關細胞因子水平的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年1月至2018年1月安陽市人民醫院收治的78例伴MP感染支氣管哮喘病兒、86例單純支氣管哮喘病兒、50例健康兒童為研究對象，分別納入MP陽性組、MP陰性組、對照組。納入標準：(1)支氣管哮喘病兒符合《中國支氣管哮喘防治指南(基層版)——支氣管哮喘的診斷與鑒別診斷》[7]中支氣管哮喘診斷標準，有喘息、氣促、胸悶、咳嗽表現；(2)MP陽性病兒入院1周測定的肺炎支原體抗體(MP-IgM)效價較入院時倍數升高；(3)本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，病兒近親屬知情同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)其他呼吸道疾病、結核或其他合并細菌與病毒感染者；(2)心、肝、腎嚴重功能障礙者；(3)嚴重血液系統疾病或其他病原體感染兒童；(4)其他原因引起的喘息、氣促、胸悶、咳嗽或近期有呼吸道感染病史者。MP陽性組中男44例，女34例；年齡范圍為3～9歲，年齡(6.13±0.78)歲；支氣管哮喘病程范圍為23～29個月，病程(26.11±2.72)個月。MP陰性組中男49例，女37例；年齡范圍為3～10歲，年齡(6.15±0.75)歲；支氣管哮喘病程范圍為24～29個月，病程(26.25±2.22)個月，兩組性別、年齡、支氣管哮喘病程比較差異無統計學意義(χ2=0.005，P=0.942；t=0.167，P=0.867；t=0.362，P=0.718)。對照組中男26例，女24例；年齡范圍為3～9歲，年齡(6.14±0.76)歲，與MP陽性組、MP陰性組性別、年齡相比，差異無統計學意義(與MP陽性組比較：χ2=0.239，P=0.625；t=0.072，P=0.943；與MP陰性組比較：χ2=0.317，P=0.574；t=0.075，P=0.941)。

1.2 方法

1.2.1MP檢測方法 取受檢者靜脈血2 mL，在3 000 r/min下離心10 min，分離血清后保存于-80 ℃下待測，采用日本富士Serodia-Myco Ⅱ MP抗體診斷試劑盒，以被動凝集實驗檢測血清MP特異性抗體(MP-IgM)，嚴格按照說明書操作。MP陽性標準：滴度>1∶80，同時分為1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560等不同滴度，本研究選擇1∶80、1∶320、1∶1 280三個滴度進行分析。

1.2.2Th1、Th9、Th17及相關細胞因子水平測定 采集受檢者空腹靜脈血6 mL，其中3 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，分離單個核細胞(PBMCs)，洗滌2次后重懸于RPMI-1640培養液，進行胞外染色、細胞培養、固定破膜、胞內染色，以美國Beckman Cloulter公司提供的CytomicsTMFC500型流式細胞儀檢測各淋巴細胞膜及細胞因子熒光強度，界定CD4+IL-1+為Th1細胞，CD4+IL-9+為Th9細胞，CD4+IL-17+為Th17細胞。另取3 mL靜脈血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，保存于-80 ℃，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定γ-干擾素(IFN-γ)、白介素-18(IL-18)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。IFN-γ試劑盒購自武漢博士德公司，IL-18、TNF-α試劑盒分別由上海森雄科技實業有限公司、北京晶美生物制劑公司提供。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 觀察指標(1)比較三組病兒入院時外周血Th1、Th9、Th17及IFN-γ、IL-18、TNF-α水平；(2)分析MP陽性組中，不同MP-IgM滴度病兒外周血Th1、Th9、Th17及IFN-γ、IL-18、TNF-α水平；(3)比較MP陽性組中急性發作期、緩解期病兒外周血Th1、Th9、Th17及IFN-γ、IL-18、TNF-α水平；(4)分析MP-IgM滴度與各指標相關性。

2 結果

2.1 三組Th1、Th9、Th17及相關細胞因子比較MP陽性組外周血Th1低于MP陰性組、對照組(t=6.396，P=0.000；t=15.492，P=0.000)，MP陽性組Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平高于MP陰性組、對照組(與MP陰性組比較，tTh9=21.494，PTh9=0.000；tTh17=18.593，PTh17=0.000；tIFN-γ=6.399，PIFN-γ=0.000；tIL-18=9.361，PIL-18=0.000；tTNF-α=26.593，PTNF-α=0.000；與對照組比較，tTh9=43.186，PTh9=0.000，tTh17=35.184，PTh17=0.000，tIFN-γ=34.634，PIFN-γ=0.000，tIL-18=7.891，PIL-18=0.000，tTNF-α=34.979，PTNF-α=0.000)，MP陰性組、對照組上述指標比較也差異有統計學意義(tTh1=10.826，PTh1=0.000；tTh9=30.168，PTh9=0.000；tTh17=18.917，PTh17=0.000；tIFN-γ=30.975，PIFN-γ=0.000；tIL-18=14.071，PIL-18=0.000；tTNF-α=16.871，PTNF-α=0.000)，見表1。

2.2 不同MP-IgM滴度病兒Th1、Th9、Th17及相關細胞因子比較MP陽性病兒中，MP-IgM滴度分別為1∶80 10例、1∶160 13例、1∶320 14例、1∶640 19例、1∶1 280 10例、1∶2 560 12例，本研究選擇1∶80、1∶320、1∶1 280滴度進行分析。隨MP-IgM滴度增加，Th1呈下降趨勢，而Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α上升，尤其是Th9、Th17、TNF-α在不同滴度病人中比較均差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 不同哮喘發作期病兒Th1、Th9、Th17及相關細胞因子比較MP陽性病兒中，急性發作期40例、緩解期38例，急性發作期Th1低于緩解期，急性發作期Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α高于緩解期(P<0.05)，見表3。

2.4 MP-IgM滴度與各指標相關性分析相關性分析顯示，支氣管哮喘伴MP感染病兒MP-IgM滴度與外周血Th1呈負相關，與Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α呈正相關(P<0.05)，見表4。

表4 MP-IgM滴度與各指標相關性分析

3 討論

支氣管哮喘是兒童常見變態反應性疾病，我國第三次城市兒童哮喘流行病學資料調查顯示，兒童哮喘的患病率、累計患病率與前次調查相比，分別增加50.6%、52.8%[8-9]。T細胞尤其是Th1及Th9細胞、Th17細胞在誘導哮喘發作、氣道炎癥方面已被證實具有重要作用，復雜的免疫反應會導致Th1細胞表達缺失，而導致Th9細胞、Th17細胞表達增加，有研究發現輕中度過敏性哮喘病人急性發作期Th9細胞、Th17細胞的特異性基因表達與特異性細胞因子生成增加[10-11]。長期臨床實踐發現MP感染是誘發兒童支氣管哮喘的重要因素，MP誘發哮喘的機制包括MP黏附纖毛上皮細胞，引起纖毛功能損傷及上皮細胞破壞，可作為特異性抗原，引起氣道變態反應，加重哮喘兒童氣道炎癥反應，同時這也涉及病兒易感體質個體特征[12-13]。但目前關于MP感染對支氣管哮喘病兒Th1、Th9、Th17及相關細胞因子的影響較少報道。

表1 三組Th1、Th9、Th17及相關細胞因子比較

注：三組各指標整體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。與對照組比較，aP<0.05；與MP陰性組比較，bP<0.05

表2 不同MP-IgM滴度病兒Th1、Th9、Th17及相關細胞因子比較

注：MP-IgM 1∶80、1∶320、1∶1 280各滴度Th1、Th9、Th17及相關細胞因子比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。與1∶80滴度比較，aP<0.05；與1∶320滴度比較，bP<0.05

表3 伴MP陽性不同哮喘發作期病兒Th1、Th9、Th17及相關細胞因子比較

Th1細胞為CD4陽性細胞，主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等致炎因子，在活化巨噬細胞、組織細胞內微生物感染、抗腫瘤反應等方面有重要作用。其中TNF-α是一種具有多種生物學效應的細胞因子，能增加中性粒細胞與嗜酸性粒細胞功能，刺激其產生超氧化物，釋放溶酶體酶，對周圍細胞產生毒性作用，IL-18也與哮喘急性發作密切相關，IFN-γ是Th1型細胞因子，對Th2型淋巴細胞形態及功能有抑制作用[14-15]。本次研究結果顯示MP陽性組外周血Th1低于MP陰性組、對照組；MP陽性組Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平高于MP陰性組、對照組；MP陰性組、對照組上述指標比較差異有統計學意義，表明MP感染不僅會加重惡性肺部病變，也會影響支氣管哮喘病兒Th1、Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平，通過IFN-γ、IL-18、TNF-α等細胞因子，上調輔助性T淋巴細胞Th9、Th17細胞免疫反應，下調Th1，而使T淋巴細胞失衡，加重哮喘[16]，這與康玉亭等[17]通過研究得出的支原體肺炎病兒Th1、Th2型細胞因子(IL-18、TNF-α)水平升高可能在支原體肺炎伴喘息病兒中發揮重要作用的結論相似。本研究也顯示，MP陽性病兒中，隨MP-IgM滴度增加，Th1呈下降趨勢，而Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α上升，尤其是Th9、Th17、TNF-α在不同滴度病人中比較均差異有統計學意義，同時與哮喘緩解期病兒相比，哮喘急性發作期病兒Th1下降，Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平升高，這與文獻[18]的報道結果基本一致，Th1細胞主要通過分泌Th1型細胞因子，增加巨噬細胞介導的抗感染與抗細胞內病原體感染的免疫反應，主要分泌IFN-γ、TNF-α，Th9可分泌高水平IgE，產生氣道嗜酸性粒細胞性炎癥，促進氣道黏液分泌與嗜酸性粒細胞聚集，增加氣道高反應性[19]，而Th17具有相對獨立的增殖、分化、調節機制，可特異性產生IL-17等細胞因子，激活哮喘病人成纖維細胞、巨噬細胞，產生并分泌一系列與氣道重構有關的細胞因子如TNF-α等，參與介導哮喘的發病與調節[20]，因而本次研究可觀察到隨MP-IgM滴度增加，哮喘急性發作，支氣管哮喘病兒Th1下降，而Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α呈上升趨勢。此外本研究相關性分析也顯示，支氣管哮喘伴MP感染病兒MP-IgM滴度與外周血Th1呈負相關，與Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α呈正相關，進一步證實了MP感染與支氣管哮喘病兒Th1、Th9、Th17及相關細胞因子的關系。

綜上所述，MP感染可下調支氣管哮喘病兒Th1，上調其Th9、Th17、IFN-γ、IL-18、TNF-α水平，而加重氣道高反應性，尤其在哮喘急性發作期上述因子變化更明顯，臨床應加以監測。