高效液相-質譜聯用法測定改善睡眠類保健食品中的非法添加物

孫曉，田仁芳，董靖，賈寒冰，張亞鋒

近年來，人們健康意識不斷提升，對保健食品的需求也不斷增加[1]。為了提高產品的市場競爭力，仍有人鋌而走險將化學藥品加入保健食品中，使保健食品產生速效作用，在短期內騙取群眾口碑，進而增加銷量謀取巨額利潤[2]。其中，改善睡眠類保健食品需求量較大，臨床上應用廣泛的安神類化學藥物成為了增強此類產品療效的優先選擇[3-4]。人們如果長期攝入這類化學藥物，容易產生藥物依賴性，因此對該類產品的風險監測迫在眉睫[5]。

目前保健食品中非法添加物的檢測方法有薄層色譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、高效液相-質譜聯用法(HPLC-MS)等。其中薄層色譜法、紫外分光光度法操作簡便，所需時間短，但專屬性較弱[6]。高效液相色譜法具有靈敏度高、專屬性好、設備費用適中的優點，但缺點是對于具有相同色譜行為，相同紫外吸收的同母核修飾化合物不具備分離鑒定能力[7-8]。本研究采用目前最先進科學的HPLC-MS/MS分析測試方法，于2016年7月開展研究，經大量方法學考察，結果證明該方法靈敏度最高、專屬性最強。能較大程度避免假陽性結果的產生，同時能做到微量甚至痕量的準確分析，又能避免假陰性結果的產生[9]，可推廣應用于改善睡眠類保健食品中的非法添加物的檢測監管，進而保障群眾用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent1200-6410B高效液相色譜-質譜聯用儀(檢測器三重四級桿QQQ，美國Agilent公司)；電子分析天平(德國Mettler-Toledo系列)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥青藤堿(批號：110774-200507)；佐匹克隆(批號：100870-200801)；文法拉辛(批號：100543-200401)；羅通定(批號：100452-200301)，以上標準物質均購自中國藥品生物制品檢定院；氯苯那敏(中國食品藥品檢定研究院，批號：100047-200606)；褪黑素(Dr.Ehrenstorfer.GmbH，批號：41222)；扎來普隆(TRC，批號：4-ANR-96-1)。甲醇、冰醋酸(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)；乙酸銨(Aladdin，色譜純)、乙腈(Merck，色譜純)；水(實驗室自制，超純水)。樣品為本市轄區內隨機抽樣所得，001號為夢香源膠囊，002號為白色粉末，003號為安睡片。取陰性樣品，加入上述混合標準物質適量，充分混合均勻，作為模擬陽性樣品。

2 方法與結果

2.1 色譜-質譜條件色譜柱為CAPCELLPAK C18MG Ⅲ C18(150 mm×2.0 mm，5 μm)。流動相A為乙腈，流動相B為0.01 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%乙酸)，梯度洗脫：0～6 min，20%A；6～6.5 min，20%～40%A；6.5～15 min，40%～45%A；15～30 min，45%A；30～31 min，45%～20%A；31～36 min，20%A。流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；檢測器QQQ，離子源ESI+，霧化氣溫度300 ℃，霧化氣流速10 L/min，MRM掃描，MRM母離子/子離子信息見表1[10-11]。

表1 化合物多反應監測離子信息

注：a為定量離子

2.2 標準物質溶液的配制分別精密稱取青藤堿、佐匹克隆、褪黑素、文法拉辛、氯苯那敏、羅通定、扎來普隆標準物質各10.00 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度搖勻，作為標準物質儲備溶液；用刻度移液管分別精密移取以上標準物質儲備溶液5 mL，置于50 mL容量瓶中，搖勻，作為混合標準物質溶液。

2.3 供試品溶液的制備取供試品5粒置于研缽中研磨均勻，精密稱取0.45 g，于50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，取出放冷至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，備用。吸取上清液適量稀釋500倍，0.22 μm有機系微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。如果樣品未檢出非法添加物，建議再過濾一瓶未稀釋的供試品母液，以排除假陰性結果。

2.4 專屬性試驗分別取陰性樣品樣品、模擬陽性樣品按“2.3”項下處理，取混合標準物質、陰性樣品、模擬陽性樣品按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果模擬陽性樣品在與混合標準物質各組分相同保留時間處，離子流圖一致。表明該方法可有效排除雜志干擾，專屬性良好。總離子流圖(TIC圖)見圖1。

2.5 標準工作曲線溶液的配制精密吸取“2.2”項下混合標準物質溶液適量，依次用甲醇稀釋定容，制成混合標準工作曲線溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數r，結果表明各組分線性關系良好，見表2。

表2 標準曲線方程

2.6 精密度試驗精密吸取混合標準物質溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，連續進樣6次，記錄峰面積，分別計算7種組分的RSD(n=6)分別為1.37%，1.79%，1.01%，0.96%，1.51%，1.21%，0.86%，結果表明儀器精密度良好。

2.7 檢出限試驗將各組分標準物質逐級稀釋，計算信噪比S/N=3時各組分濃度，結果確定青藤堿、佐匹克隆、褪黑素、文法拉辛、氯苯那敏、羅通定、扎來普隆檢出限分別是1.78、2.17、1.76、1.70、1.90、2.19、1.58 ng/mL。

2.8 重復性試驗精密稱取模擬陽性樣品6份，按照“2.3”項下方法同法處理，得到平行樣品6份，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算6份樣品中7種組分的RSD分別為1.74%、1.91%、1.12%、0.99%、1.49%、0.97%、0.89%，結果表明該方法的重復性良好。

2.9 穩定性試驗精密吸取模擬陽性樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h按“2.1”項下色譜條件測定測定，記錄峰面積，分別計算7種組分的RSD(n=6)分別為1.23%、1.01%、1.69%、0.91%、1.51%、1.03%、1.08%，表明樣品12 h穩定性良好；精密標準物質溶液，分別在0、2、4、8、16、36 h按“2.1”項下色譜條件測定測定，記錄峰面積，分別計算7種組分的RSD(n=6)分別為1.49%、1.17%、1.39%、1.27%、1.55%、1.26%、1.73%，表明標準物質12 h穩定性良好。

2.10 加標回收試驗精密稱取已知含量的樣品9份，分為三組，每組3份，分別向每份樣品加入混合標準物質溶液適量，制成高、中、低三梯度三平行的加標回收樣品，按照“2.3”項下同法處理該9份樣品，按“2.1”項下色譜條件測定，計算各組分回收率，結果表明該方法回收率可靠、穩定，見表3。

2.11 樣品測定稱取3批次保健食品樣品，按照“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下色譜條件測定，計算各組分含量，結果2批次未檢出非法添加組分，1批次僅檢出褪黑素，見表4。

3 討論

本文所研究的檢測方法，采用了更為先進、科學的HPLC-MS聯用法。相比于傳統的高效液相色譜法、薄層色譜法、理化鑒別等方法，能夠極大程度上避免假陽性和假陰性結果的產生，靈敏度更高，定性/定量結果更準確，分析速度更快。

注：1.青藤堿；2.佐匹克隆；3.褪黑素；4.文法拉辛；5.氯苯那敏；6.羅通定；7.扎來普隆圖1 總離子流圖:A為混合標準物質；B為陰性樣品；C為模擬陽性樣品

組分樣品含量/(ng/mL)加標量/(ng/mL)測得量/(ng/mL)梯度1梯度2梯度3梯度1梯度2梯度3平均回收率/%RSD/%青藤堿0.005.476.848.215.246.518.150.005.476.848.215.336.548.240.005.476.848.215.296.508.1797.21 2.10佐匹克隆0.005.877.288.745.657.168.500.005.877.288.745.637.078.440.005.877.288.745.767.218.4997.31 1.06褪黑素0.005.426.778.125.116.517.930.005.426.778.125.116.577.910.005.426.778.125.046.567.8995.99 1.79文法拉辛0.005.216.527.825.156.317.510.005.216.527.825.106.267.440.005.216.527.825.226.397.5597.27 1.63氯苯那敏0.005.857.318.775.897.248.620.005.857.318.775.847.278.560.005.857.318.775.837.258.6099.09 0.97羅通定0.006.728.4010.086.378.099.690.006.728.4010.086.398.109.610.006.728.4010.086.378.119.5695.59 0.79扎來普隆0.006.057.569.075.897.548.950.006.057.569.075.887.618.830.006.057.569.075.927.498.9598.51 1.21

表4 樣品測定結果/(g/kg)

將現有標準(編號2013002和編號2012004)中所囊括的7種安神類非法添加物質[12-13]，由三種體系檢測改進為單體系單針檢測，效率更高結果更準確。相比于(編號BJS 201710)前處理過程，本研究方法增加了稀釋步驟，可有效預防解決質譜檢測器的污染問題；其次本方法針對改善睡眠類保健食品違禁藥物添加問題，選擇了針對性更強的化學添加藥物進行檢測，待測組分離子響應更強，干擾更小。

綜上所述，本研究方法能夠有效地縮短檢測時間，節省實驗人員、儀器、試劑等方面的成本，加快實驗進度，提高實驗準確度，提高了監管分析工作效率，具有很好的應用價值及前景。