雙調蛋白對小鼠呼吸機相關性肺損傷的保護作用及機制研究

蒙臣，王思露，鐘政，王賢裕，昌睿杰

對于全身麻醉與呼吸衰竭的病人，機械通氣是非常關鍵的呼吸支持治療措施[1]。然而當潮氣量設定過高時，機械通氣本身就會導致肺組織受損而引發呼吸機相關性肺損傷(ventilator-associated lung injury,VALI)，嚴重時可能引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)而危及生命[1-2]。目前臨床上針對VALI的治療主要集中在優化機械通氣、限制液體輸注與抑制炎癥反應等方面，但尚無特效措施，因此，尋求新的有效治療VALI方法的仍然是亟待解決的重要問題[3]。雙調蛋白(Amphiregulin,Areg)是一種上皮生長因子，具有抑制細胞凋亡和保護組織器官的作用[4]，在過度通氣的離體肺組織中Areg有顯著表達[5]。然而，Areg對VALI有何作用至今仍不清楚。本研究于2016年9月到2017年5對Areg在VALI中的具體作用及可能機制進行探討，以期為VALI的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑雄性C57BL/6小鼠(周齡為6～8周，體質量20～24 g)購自武漢大學動物實驗中心[動物合格證號：42000900000381；許可證號：SYXK(鄂)2016-0031]，ALC-V8S小動物呼吸機購自中國奧爾科特公司，動物處置符合倫理學原則。使用的試劑有：重組小鼠Areg蛋白(rmAreg)(R&D公司，批號989-AR-100)、表皮生長因子受體(EGFR)抗體(Abcam公司，批號ab40815)、磷酸化表皮生長因子(P-EGFR)抗體(CST公司，批號#3777)、蛋白激酶B (AKT)(CST公司，批號#4691)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)抗體(CST公司，批號#13038)、β-actin抗體(Santa Cruz公司，批號sc-47778)和BCA蛋白檢測試劑盒(Thermo公司，批號23250)。另外,Areg(批號DY989)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(批號MTA00B)與白細胞介素-6(IL-6)(批號M6000B)的酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒購于美國R&D公司，免疫球蛋白M(IgM)的ELISA試劑盒購于中國NeoBioscience公司(EMC129.96)，蛋白提取試劑盒KGP250購自中國南京建成公司，二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma-Aldrich公司，EGFR阻斷劑AG1478和AKT抑制劑派立福新(Perifosine)購于美國Selleck Chemicals公司。

1.2 VALI動物模型的制備與分組C57BL/6小鼠經硫噴妥鈉(80 mg/kg)麻醉后行氣管插管，接小動物呼吸機行大潮氣量機械通氣制備VALI模型[6]：吸入空氣，潮氣量12 mL/kg，呼吸頻率90次/分，通氣維持4 h。rmAreg溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，給予每只小鼠腹腔注射5 μg。小鼠根據隨機數字表法隨機分為8組：①對照組(Control組)，每只腹腔注射PBS 200 μL，維持正常呼吸；②Areg組，腹腔注射rmAreg，維持正常呼吸；③PBS+VALI組，腹腔注射PBS，30 min后行機械通氣；④Areg+VALI組，腹腔注射rmAreg，30 min后行機械通氣；⑤DMSO+VALI組；⑥DMSO+Areg+VALI組，每只腹腔注射DMSO 100 μL，30 min后腹腔注射PBS或rmAreg，再經30 min后行機械通氣；⑦AG1478+Areg+VALI組與⑧Perifosine+Areg+VALI組，每只腹腔注射AG1478 1 mg或Perifosine 1 mg，30 min后腹腔注射rmAreg，再經30 min后行機械通氣。

1.3 肺組織病理學檢測與肺損傷評分機械通氣結束24 h后取小鼠左肺，使用4%甲醛固定，再用石蠟包埋。將肺組織切成5 μm切片，行HE染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化。根據美國胸科協會發布的標準對肺組織實行肺損傷評分[7](評分范圍為0～1分)，見表1。總評分=[(20×A)+(14×B)+(7×C)+(7×D)+(2×E)]/視野數×100)。

表1 肺損傷的評分標準

1.4 ELISA與BCA蛋白檢測在機械通氣結束3、6、12、24 h后，根據我們之前的方法行肺泡灌洗[8-9]：分離小鼠氣管，將1 mL的PBS從氣管緩慢注入肺內，然后慢慢回抽，重復3次，回收的支氣管肺泡灌洗液(BALF)體積>2.7 mL視為合格。將收集的BALF用400g離心10 min，收集上清液。嚴格按照ELISA與BCA蛋白檢測試劑盒中的說明書操作，檢測BALF中Areg、TNF-α、IL-6、IgM與總蛋白濃度。

1.5 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測機械通氣結束6 h后提取小鼠右側肺組織蛋白，加入上樣緩沖液，于沸水中煮10 min變性。然后行上樣、電泳、轉膜操作，在5%脫脂牛奶中封閉1 h。分別使用β-acitn、EGFR、P-EGFR、AKT與p-AKT一抗(1∶1 000)于4 ℃中孵育過夜。加入二抗(1∶3 000)孵育1 h，在EC3凝膠成像系統下曝光并拍照，使用Image J軟件處理并分析目標條帶中的光密度值。

2 結果

2.1 VALI肺組織中Areg的表達與未行機械通氣(0 h組)的小鼠相比，在大潮氣量機械通氣后24 h內，小鼠BALF中的Areg濃度均有明顯升高(見圖1)，其中在機械通氣結束后6 h，BALF中的Areg濃度[(231.8±58.7) pg/mL]升高最為顯著。

注：與0 h組相比，aP< 0.05，bP< 0.01，cP< 0.001圖1 VALI后24 h內小鼠BALF中Areg的濃度變化(n=4)

2.2 Areg對VALI肺組織病理變化的影響與Control組相比，單獨使用rmAreg對肺組織病理學并無影響(Control組 比 Areg組)，見圖2A和圖2B。但在接受大潮氣量機械通氣的小鼠中，肺組織肺泡壁顯著增厚，中性粒細胞浸潤增加，透明膜形成明顯，見圖2C。而使用rmAreg處理顯著減輕了肺組織的肺泡壁厚度、中性粒細胞浸潤與透明膜形成(PBS+VALI組 比 Areg+VALI組)，見圖2D，抑制了肺組織病理學損傷，明顯改善了肺損傷評分,見圖2E。

注：與Control組相比，aP< 0.001；與PBS+VALI組相比，bP< 0.05圖2 Areg對VALI小鼠肺組織病理學及肺損傷評分的影響(HE染色，20×20倍，n=6)：A為Control組；B為Areg組；C為PBS+VALI組；D為Areg+VALI組；E為各組肺損傷的比較

2.3 Areg對VALI肺組織滲透性與炎癥反應的影響本實驗結果顯示，大潮氣量機械通氣顯著增加了小鼠BALF中的TNF-α與IL-6(圖3A和圖3B)、總蛋白與IgM(圖3C和圖3D)濃度(PBS+VALI組 比 Control組)，而使用rmAreg處理則顯著抑制了這些指標的升高(Areg+VALI組 比 PBS+VALI組)。

2.4 Areg對VALI肺組織EGFR與AKT的影響Western Blot的光密度分析顯示(圖4)，與Control組相比，大潮氣量機械通氣可增加肺組織中的EGFR與AKT磷酸化水平(PBS+VALI組 比 Control組)；使用rmAreg處理不僅可以使正常小鼠肺組織中的EGFR與AKT發生磷酸化(Areg組 比 Control組)，還可以進一步增加VALI小鼠肺中的EGFR與AKT磷酸化水平(PBS+VALI組 比 Areg+VALI組)。

2.5 AG1478與Perifosine對Areg保護效果的影響分別使用EGFR抑制劑AG1478與AKT抑制劑Perifosine處理小鼠，再檢測Areg對VALI小鼠的肺保護作用。HE結果顯示(圖5A)，與DMSO+Areg+VALI組相比，AG1478+Areg+VALI組與Perifosine+Areg+VALI組小鼠肺組織肺泡壁明顯增厚，中性粒細胞浸潤水平顯著增高。BALF中蛋白檢測顯示(圖5B～E)，相較于DMSO+Areg+VALI組，AG1478+Areg+VALI組與Perifosine+Areg+VALI組BALF中TNF-α、IL-6、總蛋白與IgM濃度均有明顯增加。

注：與Control組相比，aP< 0.001；與PBS+VALI組相比，bP< 0.01圖3 Areg對VALI小鼠肺組織炎癥反應及滲透性的影響(n=5)：A、B、C、D分別為各組BALF中TNF-α、IL-6、總蛋白與IgM的濃度

注：與Control組相比，aP< 0.001；與PBS+VALI組相比，bP< 0.05，cP<0.01圖4 Areg對VALI小鼠肺組織EGFR與AKT磷酸化的影響(n=5)：A為小鼠肺組織中EGFR、P-EGFR、AKT與p-AKT的Western Blot檢測結果；B、C分別為P-EGFR/EGFR、p-AKT/AKT的光密度比值

注：與DMSO+VALI組相比，aP< 0.01；與DMSO+Areg+VALI組相比，bP< 0.05圖5 AG1478與Perifosine對Areg保護效果的影響：A為肺組織HE染色(20×20倍，n=6)；B、C、D、E分別為BALF中TNF-α、IL-6、總蛋白與IgM的濃度(n=5)

3 討論

早在2006年，Dolinay等[5]就已發現離體肺組織受到過度牽拉后會大量表達Areg，但Areg對VALI的作用一直未被詳細闡明。有些研究將Areg作為肺損傷嚴重程度的一個判定指標[10]，暗示了Areg可能有促進肺部損傷的作用。我們之前的研究證實，Areg對細菌內毒素引發的急性肺損傷有保護作用[9]。而在本實驗中，我們首次證明了Areg能顯著抑制大潮氣量機械通氣所導致的肺組織損傷。

與內毒素引發的肺組織炎性損傷機制不同，VALI主要是因為大潮氣量通氣過度擴張肺泡而引起肺泡牽拉受損所致[11]。然而，在損傷效應上VALI與內毒素肺損傷類似，表現為肺組織病理形態異常、通透性增加與炎癥反應激活[7]。在本實驗中，我們選取了與臨床密切相關的大潮氣量機械通氣(潮氣量為12 mL/kg、通氣4 h)制作VALI模型[6]。可以看出在行大潮氣量機械通氣結束24 h后，肺組織有明顯的病理損傷，表現為中性粒細胞浸潤增加、肺泡壁增厚與透明膜形成等(圖2)。而BALF中TNF-α與IL-6、IgM與總蛋白含量的明顯升高(圖3)也分別證明了肺組織在過度機械通氣后炎癥反應被大量激活、滲透性顯著增加，這些結果證明我們成功制作了VALI模型。

已有離體細胞實驗證實，肺泡上皮細胞在受到過度牽拉時會表達Areg[12]，而離體的肺組織在行過度通氣后Areg的基因水平也有明顯升高[5]。我們則在接受了大潮氣量機械通氣的小鼠BALF中檢測到Areg有大量表達，與離體的肺泡上皮細胞與肺組織實驗結果一致，這說明過度牽拉會使肺組織中的Areg表達量顯著升高。在細菌內毒素引起的急性肺損傷中，Areg來源于經典激活型肺泡巨噬細胞[9]，但在VALI中，Areg則很可能來源于被牽拉的肺泡上皮細胞，而這一點還需要在今后的活體實驗中進一步證明。

Areg是上皮生長因子(EGF)類家族的一員，能夠促進細胞的生存、增殖和分化，因此具有保護損傷組織的作用[4]。研究表明，當腸組織受到炎癥傷害時，Areg的產生有助于腸黏膜的保護和修復[13]；在肝臟的急性炎癥中，Areg的缺失會使肝臟損傷明顯加重[14-15]。我們之前也證實了Areg能抑制肺泡上皮細胞凋亡[9]。在本實驗中，給予外源性Areg可以大大減輕大潮氣量機械通氣所導致的肺損傷病理學變化，并顯著改善肺組織的通透性與炎癥反應，說明了Areg對于VALI肺組織也有明顯的保護作用。

本實驗中，我們發現在VALI發生6 h后，肺組織中的Areg表達升高最為顯著。而EGFR是Areg的唯一受體[16]，在肺組織中有廣泛表達。活化的EGFR可激活調節細胞生存的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT通路[17]。因此，我們選擇在VALI發生后6 h檢測EGFR與AKT的活化水平。結果顯示，EGFR與AKT均有明顯的磷酸化，與我們之前在內毒素誘導的肺損傷小鼠中所觀察的結果一致[9]。在內毒素刺激后，肺組織中的EGFR能被自身大量表達的Areg所激活。VALI發生后，肺組織中的Areg表達量也有明顯升高，因此，VALI肺組織中EGFR與AKT的磷酸化很可能也是由分泌的Areg所引起。本實驗還發現，給予外源性Areg處理后，VALI肺組織中的EGFR與AKT磷酸化進一步加強了。研究已證實，EGFR-AKT能顯著增強細胞的生存能力，如在肝細胞中，抑制AKT后，Areg對抗細胞凋亡的能力明顯降低[18]，說明AKT是Areg-EGFR通路發揮保護作用的重要組成部分。而且AKT的磷酸化水平與急性肺損傷的傷害程度密切相關[19]：當肺組織的AKT激活水平降低后，肺組織的損傷程度會明顯加重；而且AKT的活化能直接促進肺泡上皮細胞的生存[20]。為了驗證EGFR-AKT通路對Areg肺組織保護作用的影響，我們分別使用EGFR阻斷劑AG1478[21]、AKT抑制劑Perifosine[22]做預處理，再行Areg干預。結果顯示，抑制EGFR與AKT幾乎消除了Areg對VALI肺組織病理損傷、炎癥反應及滲透性變化的負性調控作用。因此，EGFR與AKT的活化是Areg在VALI中發揮保護作用的主要機制。

綜上所述，本研究確認了活體肺組織在受到大潮氣量機械通氣后會大量表達Areg，并首次發現Areg能夠通過激活EGFR-AKT通路減輕大潮氣量機械通氣所引發的肺損傷，表現為減輕肺組織病理學變化與滲透性、抑制炎癥反應，因此證明了Areg在VALI中具有明顯的保護作用。