白藜蘆醇對化療所致大鼠卵巢損傷的保護作用

朱小丹 董若曦 陳 燕 吳曉慧 姚馨怡 許文娟 樊伯珍

早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)指女性在40歲之前卵巢功能衰退的臨床綜合征，以月經紊亂(如停經或稀發月經)伴有高促性腺激素和低雌激素為特征，是一種較為嚴重的威脅生殖健康的疾病。近年來，隨著化學治療藥物的廣泛使用，化療導致的卵巢損傷成為POI的重要病因。目前對于化療性卵巢損傷的保護，所探索的各種藥物和方法均存在一定的局限性。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種存在于葡萄、花生根莖和多種藥用植物中的1,2-二苯乙烯化合物多酚，有較強大的抗氧化功能，能阻止血小板凝聚、防止人體低密度脂蛋白氧化、清除自由基，并能改善修復卵母細胞損傷，改善卵母細胞質量，減輕氧化損傷所致老化和與年齡相關的疾病[1]。本研究旨在探討白藜蘆醇預防性應用對化療后卵巢組織結構、各級卵泡數量、內分泌功能所起的一系列作用，為臨床腫瘤治療和免疫性疾病中應用大劑量的化療藥物時所導致的卵巢損傷，提供有效的保護方法和科學依據。

材料與方法

1.實驗動物:近交系雌性Wistar大白鼠，8周齡。體質量180～200g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于上海中醫藥大學附屬普陀醫院中心實驗室動物房。喂食無特殊病原體(SPF)級鼠飼料及凈化水，室溫20～25℃，相對濕度45%～55%。每日光照12h，飼養1周熟悉環境后，每日清晨9:00行陰道涂片，顯微鏡下觀察動情周期，選用有正常動情周期的40只大鼠進入實驗。

2.實驗試劑：順鉑凍干粉購自山東齊魯制藥有限公司；白藜蘆醇購自上海祥弘生物科技有限公司；酶聯免疫法E2、FSH、AMH試劑盒均購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

3.實驗分組及處理：40只雌性Wistar大鼠采用數字表法隨機分成4組，即對照組、腹腔化療組(CP模型組)、低劑量白藜蘆醇+腹腔化療組(低Res組)、高劑量白藜蘆醇+腹腔化療組(高Res組)，每組10只大鼠。在21天的實驗期間，對照組不給于任何藥物處理，CP模型組給予生理鹽水1ml/d灌胃，低Res組、高Res組則分別給予白藜蘆醇25mg/(kg·d)、75mg/(kg·d)溶于生理鹽水1ml中灌胃。在實驗第15天，除對照組外，其余3組大鼠均稱質量后，單次給予順鉑(5mg/kg)，用生理鹽水稀釋至2ml，注射入腹腔內。

4.標本提取及檢測：實驗第21天，即順鉑腹腔注射后1周，各組大鼠完成全部給藥后24h，對所有大鼠進行麻醉。取腹主動脈血，于室溫下靜置2h后，3000r/min離心15min。按照酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒說明書進行操作，測定血清E2、FSH、AMH濃度。處死各組大鼠，取出雙側卵巢稱。卵巢組織脫水后，10%甲醛固定24h，經過常規石蠟包埋。連續切片厚度5μm，每隔9張即取第10張切片，用蘇木精和伊紅染色。在400倍光學顯微鏡下觀察卵泡發育，進行各級卵泡計數:原始卵泡、生長卵泡(初級泡數+次級卵泡)、成熟卵泡數量。

結 果

1.各組大鼠血清激素水平的變化:各組大鼠血清中E2和FSH濃度比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，CP模型組大鼠血清AMH濃度降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與CP模型組比較，白藜蘆醇高、低劑量給藥組大鼠血清AMH濃度增高，差異有統計學意義(P<0.05)；而低Res組和高Res組比較，血清AMH濃度差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠血清E2、FSH、AMH濃度

與對照組比較，*P<0.05;與CP模型組比較，#P<0.05

2.各組大鼠卵巢濕質量的變化：取材后稱量大鼠卵巢濕質量，與對照組比較，CP模型組大鼠卵巢濕質量減輕，差異有統計學意義(P<0.05)；與CP模型組比較，高Res組、低Res組大鼠卵巢濕質量增加，差異有統計學意義(P<0.05)，而高Res組、低Res組比較，大鼠卵巢濕質量差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠卵巢濕質量

與對照組比較，*P<0.05;與CP模型組比較，#P<0.05

3.各組大鼠卵泡數目的變化:與對照組比較，CP模型組大鼠原始、生長、成熟卵泡的數量均明顯減少(P<0.05)。與CP模型組比較，白藜蘆醇高、低劑量給藥組各級卵泡數均明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)，低Res組與高Res組比較，各級卵泡數量增多，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖1、表3。

討 論

本研究發現，通過白藜蘆醇的治療，大鼠血清AMH表達水平的升高差異有統計學意義。組織學檢查顯示，白藜蘆醇能通過保護原始、生長和成熟卵泡，來減少順鉑誘導的卵巢損傷。

圖1 各組大鼠卵巢中的各期卵泡(HE，×200)A.對照組；B.CP模型組；C.低Res組；E.高Res組。原始卵泡；生長卵泡；成熟卵泡

表3 各組大鼠卵巢內各期卵泡數

與對照組比較，*P<0.05；與CP模型組比較，#P<0.05

近年來，隨著化療藥物和靶向治療的進展，腫瘤和免疫性疾病的緩解和治愈率正在穩步提高。但化療可能導致卵巢儲備下降，甚至完全性卵巢功能衰竭。順鉑是一種廣泛應用的化療藥物，用于治療大多數類型的癌癥。研究發現，順鉑可促使人卵巢顆粒細胞的凋亡和原始卵泡的破壞，可導致以卵泡細胞凋亡增加、AMH分泌減少、動情周期紊亂等為特征的卵巢衰竭[2，3]。在化療引起的卵巢損傷中，可通過測定激素如促卵泡激素(FSH)，雌二醇(E2)，抑制素B(inhibit B)和抗苗勒試管激素(AMH)的血漿水平來評估藥物的保護作用[4]。

AMH是一種由小發育卵泡產生的二聚體蛋白質，血漿AMH水平不隨月經周期而改變。隨著女性年齡的增長，AMH水平下降，與卵巢儲備能力呈正相關。相比其他激素，這是一個更為敏感的卵巢儲備指標[5]。Yeh等[6]評估血清AMH和FSH水平、卵巢AMH的表達和卵泡的形態(一級、二級和竇卵泡)作為生物標志物在順鉑誘導卵巢損傷中的變化，結果表明AMH在血清及卵巢組織中的表達呈順鉑劑量依賴式降低，這種減少的基本機制和卵泡凋亡的增加有關。Erba等[7]研究了催產素對順鉑損傷的卵巢組織的治療作用，確定了順鉑導致大鼠血清AMH水平顯著降低。所以，血清AMH水平可作為順鉑誘導卵巢損傷的生物標志物。

本研究發現，腹腔注射順鉑5mg/kg可顯著減少原始、初級和次級卵泡的數目，降低血清AMH的水平，證實了順鉑化療對卵泡細胞有毒性作用。Erba等[7]在順鉑治療大鼠中也發現了原始卵泡數目明顯下降，并在組織病理學評估卵泡，發現順鉑治療損傷大多數卵泡顆粒層，降低卵泡的完整性，與本研究結果一致。但本研究中各組大鼠E2和FSH的監測未發現差異有統計學意義，這可能和大鼠的動情周期，以及E2、FSH的脈沖釋放有關。

白藜蘆醇是一種多酚類，非類黃酮類抗氧化劑。它是在葡萄皮和高劑量紅葡萄酒中發現的植物抗毒素[8]。它具有抗炎、抗氧化和免疫調節功能，通過上調細胞中的抗氧化系統發揮抗氧化功能，也對自由基具有直接的破壞作用[9]。Rubiolo等[10]研究發現，通過用25mg、50mg和75mg劑量的白藜蘆醇可活化抗氧化酶活性，保護受氧化應激損傷的原代培養的大鼠肝細胞免受氧化損傷，50mg組的保護效應最顯著。Liu等[11]在一項白藜蘆醇對大鼠年齡相關不孕癥的影響的研究中，將白藜蘆醇30mg/L[約7mg/(kg·d)]加入飲用水中6和12個月，并在白藜蘆醇和對照組中評估卵巢功能和生育力，結果表明，白藜蘆醇能保護免受年齡相關的生育力變化，促進卵母細胞數量和質量的恢復，并保持了健康的卵泡數量。這些研究發現支持白藜蘆醇延緩卵巢衰老的假說。

白藜蘆醇的這些作用可能與端粒長度和端粒酶活性增加，與生殖細胞功能障礙減少和SIRT1激活有關。Kong等[12]研究了白藜蘆醇的作用對不同年齡大鼠卵巢發育的影響，20mg/(kg·d)的白藜蘆醇處理顯著增加卵母細胞總數，閉鎖卵泡數目減少，并抑制了細胞凋亡以及卵泡從原始階段向其他階段的轉變階段。Chen等[13]研究了影響中藥多酚對衰老大鼠卵巢儲備的保護作用，并顯示已經用白藜蘆醇治療的老鼠4個月有更健康的卵泡和更少的閉鎖卵泡。Atli等[14]研究發現白藜蘆醇治療增加了大鼠發育卵泡，減少閉鎖卵泡的數量，并保護卵巢功能抵抗氧化損傷。在本研究中，低Res組給予25mg/kg，高Res組給予75mg/kg白藜蘆醇共21天，第15天給予單次劑量5mg/kg 順鉑腹腔內注射。低劑量和高劑量白藜蘆醇組的AMH水平均較順鉑模型組顯著升高。組織學病理發現低劑量和高劑量白藜蘆醇組的原始、生長、成熟卵泡均比順鉑組高。

Simsek等[15]研究了白藜蘆醇對全身放射治療引起的大鼠急性卵巢毒性的療效，并表明在照射前施用生理劑量白藜蘆醇(10mg/kg)的總卵泡數量比對藥物劑量(100mg/kg)具有更大的保護作用。這一發現被認為與高劑量白藜蘆醇的促凋亡作用有關。Tseng等[16]報道，100mg/kg劑量的白藜蘆醇誘導大鼠大腦神經膠質瘤細胞凋亡。同樣，Chao等[17]研究發現,白藜蘆醇對人垂體瘤GH3細胞具有濃度依賴性雙相作用，并且表明在較低劑量(1μmol/L)下，白藜蘆醇增加細胞增殖，而在10μmol/L或更高劑量下，誘導細胞凋亡。本研究中低劑量白藜蘆醇組各級卵泡數量明顯比順鉑模型組較高。但高劑量白藜蘆醇組的原始、生長、成熟卵泡數量并沒有明顯低于低劑量白藜蘆醇組，這些結果可以通過白藜蘆醇的濃度依賴性雙相效應來解釋。這項研究表明，適當劑量的白藜蘆醇可能通過增加健康卵泡的數量來保護卵巢功能。

本實驗研究表明，順鉑腹腔化療會破壞大鼠卵巢結構，顯著降低卵巢原始卵泡、生長卵泡和成熟卵泡的數目，降低血清AMH的濃度水平。而白藜蘆醇，特別是低劑量白藜蘆醇的預防性使用，能夠減輕順鉑對大鼠卵巢組織結構的破壞及其對卵泡生長過程的抑制作用，促進卵泡生長，增加各級卵泡數，增強卵巢的儲備能力，其具體的保護機制有待于進一步研究。