長鏈非編碼RNA TUG1對冷保存小鼠肝臟細胞的影響及其機制

羅 德 蘇 松 劉向東 劉 江 陳鑫培 周鵬程 方 程 李 波

肝移植是目前終末期肝病唯一有效的治療手段，但在手術中移植肝不可避免的要經歷冷保存過程[1]。冷保存損傷一直是影響移植物功能及受者存活率的最重要因素之一[2]。如何最大程度地減輕冷保存損傷、提高移植物存活率是肝臟移植領域面臨的巨大挑戰。長鏈非編碼RNA(long non-conding RNA，LncRNA)是指長度超過200個核苷酸，不具備蛋白質編碼功能的RNA，大量研究表明其參與多種病理、生理過程[3]。目前LncRNA在肝冷保存損傷中的作用未見報道，本課題組前期通過建立小鼠肝臟冷缺血模型應用二代測序技術比較了LncRNA表達譜變化，發現TUG1在冷缺血組織標本中呈顯著低表達，本研究旨在通過建立細胞冷保存模型來探討TUG1對冷保存小鼠肝細胞的保護作用及其可能的機制[4]。

材料與方法

1.細胞與主要試劑：原代成年小鼠肝臟細胞(HC)、肝竇內皮細胞(LSEC)購買自武漢原生原代生物醫藥科技有限公司。小鼠乳酸脫氫酶(LDH)ELISA試劑盒、CCK-8試劑盒購于南京建成公司。TUG1慢病毒由上海吉瑪制藥技術有限公司生產。總RNA提取試劑盒購于美國Zymo Research公司，TUNEL試劑盒購于美國Sigma公司，EBM-2培養基、DMEM培養基、胎牛血清購于美國Gibco公司。RIPA 試劑、BCA 試劑盒購自碧云天公司，Bax、Bcl-2、Cyt-C、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 和cleaved PARP一抗購于英國Abcam公司，GRP78、PERK、p-eIF2α、CHOP、cleaved-caspase 12和cleaved-PARP一抗購于美國CST公司。

2.實驗方法：(1)細胞培養：HC采用添加10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養基，LSEC采用EBM-2培養基，在37℃、5% CO2條件下培養。(2)小鼠肝臟細胞冷保存損傷模型建立：將培養的HC和LSEC在4℃的細胞培養基中培養12h，然后在37℃、5%CO2正常培養條件培養2h來構建細胞冷保存損傷模型。(3)TUG1表達的檢測：利用Trizol法提取細胞總RNA，用紫外分光光度計測定樣品濃度。取500ng總RNA為模板，利用oligo dT和隨機引物合成cDNA，利用SYBRG reen染料法進行實時定量PCR反應。反應體系：20μl，含cDNA 2μl，引物5pmol，SYBR Green Master mix 10μl；反應條件：50℃ 2min；95℃ 15S、60℃ 1min 40個循環。結果用Ct值分析，以GAPDH基因作為內參，折算為相對倍數確定基因表達的相對變化。所用引物采用Primer 3軟件設計，由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列為：TUG1 上游引物：5′-GGCACCCAGTGTAAAGCA-3，下游引物：5′-AAGCAGCAGATAACAGAGTTGA-3′；GAPDH 上游引物：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游引物：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。(4)TUG1過表達慢病毒感染：感染前24h，將處于對數生長期的細胞以2×105個/孔的數量接種于6孔板中，每孔加入無抗生素的培養液2ml。按照病毒的感染復數等于20，將慢病毒與培養基混和均勻，后加入待感染細胞中。24h后換液，72h后熒光顯微鏡觀察并計算轉染效率。待細胞生長至匯合度為80%時，進行常規傳代培養，用于后續實驗。(5)肝臟細胞冷保存損傷指標的檢測：采用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，ELISA試劑盒檢測細胞培養液上清中LDH含量，細胞凋亡程度通過 AnnexinV-FITC凋亡試劑盒和流式細胞儀檢測分析。(6)線粒體凋亡及內質網應激通路相關蛋白檢測：利用蛋白質印跡法檢測線粒體凋亡通路相關蛋白Bax、Bcl-2、細胞色素C、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 和cleaved PARP及內質網應激通路相關蛋白GRP78、PERK、p-eIF2α、CHOP、cleaved-caspase 12和cleaved-PARP的表達以確定線粒體凋亡通路及內質網應激通路的變化。具體方法為：利用RIPA試劑提取細胞總蛋白，BCA定量后取30μg蛋白，經聚丙烯凝膠電泳分離，經轉膜 、封閉，抗體雜交后顯影，通過Image J 掃描灰度值后計算相對水平。

結 果

1.TUG1在冷保存模型中表達下調:為了探索冷保存損傷模型中TUG1的表達變化，將HC和LSEC在4℃的細胞培養基中培養12h，然后在正常培養條件培養2h來構建細胞冷保存損傷模型，通過q-PCR檢測TUG1的表達變化。如圖1所示，與正常培養細胞比較，冷保存模型中TUG1的表達明顯降低。

圖1 冷保存12h TUG1表達情況A.HC組；B.LSEC組；與正常培養細胞比較，*P<0.05

2.過表達TUG1降低冷保存導致的細胞損傷:為了探索TUG1對冷保存損傷的影響，通過慢病毒感染的方式在HC和LSEC中過表達TUG1，如圖2所示，與陰性對照比較，慢病毒感染后TUG1表達水平明顯升高。建立細胞冷保存損傷模型，流式細胞技術檢測細胞凋亡，如圖3所示，與陰性對照組比較，TUG1高表達組的細胞凋亡明顯降低。CCK-8法檢測細胞活性，如圖 4所示，高表達TUG1組細胞活性明顯高于陰性對照組。通過檢測細胞培養液中LDH變化來判斷細胞損傷程度，如圖5所示，TUG1高表達能減輕LDH釋放。

圖2 慢病毒感染后TUG1表達情況A.HC組；B.LSEC組；與陰性對照組比較，*P<0.01

圖3 流式技術檢測細胞凋亡A.HC組；B.LSEC組;與陰性對照組比較，*P<0.01

圖4 CCK-8法檢測細胞活性A.HC組；B.LSEC組;與陰性對照組比較，*P<0.01

圖5 細胞培養液中LDH變化A.HC組；B.LSEC組;與陰性對照組比較，*P<0.01

3.過表達TUG1對線粒體凋亡及內質網應激通路相關蛋白表達的影響:為了探討TUG1對冷保存損傷保護作用的潛在機制，首先通過Western blot法檢測了線粒體凋亡相關蛋白的表達變化。如圖6、圖7所示，與陰性對照組比較，TUG1慢病毒組的Bax，Cyt-c，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3，cleaved PARP表達明顯降低，Bcl-2表達明顯上升。接著檢測了內質網應激相關蛋白的表達變化，結果如圖8、圖9所示，與慢病毒陰性對照組比較，慢病毒組GPR78、PERK、p-eIF2α、CHOP、cleaved-caspase 12和cleaved-PARP表達明顯降低。

圖6 Western blot法檢測HC細胞線粒體凋亡相關蛋白與陰性對照組比較，*P<0.01

圖7 Western blot法檢測LSEC細胞線粒體凋亡相關蛋白與陰性對照組比較，*P<0.01

圖8 Western blot法檢測HC細胞內質網應激相關蛋白與陰性對照組比較，*P<0.01

圖9 Western blot法檢測LSEC細胞內質網應激相關蛋白與對照組比較,*P<0.01

討 論

肝移植過程中供肝通常需要在2～8℃條件下保存數小時。低溫能降低細胞代謝從而延長移植物保存時間[5,6]。但是，在冷保存期間，供肝N+-K+-ATP酶活性受到抑制，引起N+-Cl-內流增加、繼發性胞內Ca2+失衡以及細胞水腫。同時，無氧代謝導致線粒體功能障礙和中性粒細胞激活，促使大量自由基產生并損傷血管內皮細胞和細胞死亡，被認為是術后移植物無功能的重要原因[7～9]。供肝短缺仍是肝移植領域中最根本的問題。有研究者認為“邊緣供肝”是解決目前供肝短缺困境的有效途徑之一，然而邊緣供肝往往來源于老齡、伴發脂肪肝以及無心跳供體(nonheart-beating donors，NHBD)，對缺血再灌注及冷保存損傷的耐受性較差，原發性移植物無功能的發生率往往高于活體肝移植供體或腦死亡供體[1,2]。因此，對供肝冷保存采取必要的保護性干預措施，從而減小損傷、改善供肝質量是目前肝移植研究領域的熱點課題之一。雖然目前對于冷保存損傷已有不少研究，但其分子機制仍不清楚。為此，本課題組前期通過建立小鼠肝臟冷保存模型，利用二代測序技術篩選出差異表達的lncRNA TUG1，并重點探究其在冷保存中的作用及其潛在機制。

LncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，參與細胞內多種生物學過程，但在肝臟冷保存損傷方面未見報道。牛磺酸上調基因1(lncRNA taurine up-regulated gene1，LncRNA TUG1)最初是在篩選牛磺酸處理的小鼠視網膜細胞基因組時被發現，其序列在哺乳動物中高度保守。研究發現在新生視網膜細胞中通過RNA干擾技術沉默TUG1可以通過增加細胞凋亡而導致光感受器的畸形或外段缺失[10]。最近研究表明TUG1影響多種腫瘤細胞的凋亡和增殖。研究發現TUG1在骨肉瘤中表達普遍上調，并調控骨肉瘤細胞的增殖和凋亡[11]。也有研究報道高TUG1的表達水平與膀胱尿路上皮癌的高分級和分期有關，沉默TUG1的表達水平導致細胞增殖抑制和凋亡誘導[12]。

已有研究顯示，肝臟冷損傷始于HC和LSEC的損傷[13，14]。因此，本研究通過建立HC和LSEC冷保存損傷模型來探討TUG1作用及其機制。本研究中發現，TUG1在冷保存的肝臟細胞中表達下調，這與本研究前期的動物實驗結果一致[4]。當細胞通過慢病毒感染上調TUG1表達后，細胞凋亡及LHD水平明顯降低，細胞活力增加，這說明TUG1對冷保存損傷具有保護作用。既往研究表明細胞凋亡受線粒體功能障礙與內質網應激信號途徑調節[15～17]。本研究通過蛋白印跡實驗比較了TUG1上調后細胞色素C、線粒體凋亡相關蛋白及內質網應激相關蛋白的表達變化來探討TUG1降低冷保存損傷的可能機制。結果顯示TUG1表達上調后，細胞色素C，線粒體凋亡相關蛋白及內質網應激相關蛋白的表達明顯降低。綜上所述，筆者推測LncRNA TUG1可能通過抑制線粒體及內質網應激通路降低細胞凋亡，從而降低細胞冷保存損傷。