牙齦卟啉單胞菌感染致患者慢性牙周炎發病的可能機制研究

周婷，吳艷

(1.四川省第四人民醫院第一門診部口腔科，四川 成都 610000；2.川北醫學院附屬醫院口腔科，四川 南充 637000)

牙周炎指的是牙周支持組織的慢性炎性疾病，可導致不可逆地侵襲與破壞牙周組織，使牙周喪失再生與修復能力，導致牙齒松動及脫落[1]。牙周炎是導致成人牙齒缺失的最主要原因之一，中間普氏菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等口腔微生物與牙周炎的發生與發展存在密切相關性[2]。牙周膜細胞是牙周膜中最主要的組成部分，在牙周組織的保護及修復中發揮著重要作用[3]。炎癥復合體是由胞質內模式識別受體家族成員之一，其中NLRP3炎癥復合體研究最為廣泛[4]。NLRP3炎癥復合體可以激活促炎性蛋白酶caspase-1，而活化的caspase-1可切割白細胞介素-1β(IL-1β)與IL-18前體，促進IL-1β與IL-18的成熟及分泌[5]。本研究旨在探討牙齦卟啉單胞菌感染致患者慢性牙周炎發病的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2015年1月至2017年12月四川省第四人民醫院進行慢性牙周炎拔牙治療的患者128例作為觀察組，以同期進行健康體檢的牙周健康的128例健康人員作為對照組。觀察組中男性54例，女性74例，平均年齡(37.1±4.4)歲；對照組中男性59例，女性69例，平均年齡(37.6±4.7)歲。比較兩組之間的性別與年齡分布，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標準

納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)無吸煙史；(3)近1個月內未曾服用非甾體抗炎及抗菌藥物。排除標準：妊娠及哺乳期婦女。

1.3 方法

采用無菌齦下刮治器刮取觀察組患者磨牙牙周袋最深位點及對照組上頜第一磨牙頰側近中位點菌斑，采用紗布隔濕干燥，將標準化滅菌紙的紙尖插至牙周袋的底部，插入10 s之后將滅菌紙取出放置于含有1 mL pH=7.2 PBS溶液的EP管中，采用實時熒光PCR對牙齦卟啉單胞菌進行檢測，位點探診深度(PD)≥4 mm，附著水平(AL)≥3 mm，臨床附著喪失(CAL)≥1 mm。將觀察組需要拔除的牙齒拔除，于無菌條件下刮取超過1/3的牙周膜組織，進行細胞培養，部分細胞采用牙齦卟啉單胞菌ACTT33277進行感染，部分不進行感染處理，加入蛋白酶抑制劑以及裂解液進行蛋白提取液制備，采用Western Blot對NLRP3蛋白進行檢測，采用酶聯免疫吸附法對IL-1β與IL-18的表達情況進行檢測。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 兩組患者牙齦卟啉單胞菌陽性率比較

觀察組牙齦卟啉單胞菌陽性率為82.0%，顯著高于對照組牙齦卟啉單胞菌陽性率18.0%，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 兩組患者牙齦卟啉單胞菌陽性率比較[n(%)]

2.2 兩組患者不同探診深度牙齦卟啉單胞菌濃度比較

在5 mm、6 mm、7 mm的探診深度時，觀察組牙齦卟啉單胞菌濃度均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

組別5 mm例數濃度6 mm例數濃度7 mm例數濃度觀察組364.2±0.5594.9±0.7335.6±0.7對照組810.4±0.1330.5±0.2140.8±0.2t值31.25833.04737.204P值0.0010.0010.001

2.3 觀察組牙周膜細胞是否進行牙齦卟啉單胞菌感染的NLRP3、IL-1β與IL-18表達比較

觀察組進行人工牙齦卟啉單胞菌感染的牙周膜細胞的NLRP3、IL-1β與IL-18表達水平顯著高于未進行人工牙齦卟啉單胞菌感染的牙周膜細胞，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

組別NLRP3IL-1β(pg/mL)IL-18(pg/mL)進行人工牙齦卟啉單胞菌感染1.4±0.31865.3±389.4320.1±44.6未進行人工牙齦卟啉單胞菌感染0.7±0.11125.8±306.7121.5±39.7t值18.9737.65322.846P值0.0010.0010.001

3 討論

慢性牙周炎患者的主要臨床表現為牙齒松動、牙齦溢膿、口臭、咀嚼無力等，不僅對患者的口腔衛生造成一定危害，還與糖尿病、冠心病、消化系統疾病存在密切相關性[6]。機體抵御病原微生物的第一道天然屏障即為機體先天免疫系統，其在機體抗感染的過程中發揮著重要作用[7]。牙周炎的發生是多因素共同作用的結果[8]，具體包括：(1)牙菌斑的作用；(2)中性粒細胞多形核白細胞防御缺陷；(3)全身易感因素如基因缺陷、吞噬細胞功能缺陷、免疫缺陷等的影響；(4)炎性因子升高。本研究旨在探討致慢性牙周炎患者牙齦卟啉單胞菌感染與NLRP3、 IL-1β與IL-18表達情況，分析慢性牙周炎發生的可能機制。

人類口腔中定植有500種左右的細菌，但大部分并非致病菌，慢性牙周炎的可疑致病微生物主要包括福賽類桿菌、變黑普氏菌、牙密螺旋體、中間普氏菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等[9-10]。牙齦卟啉單胞菌為一種革蘭陰性厭氧菌，具有菌毛、外膜蛋白、牙齦素、膜泡等多種毒力因子，定植于口腔中的多種組織內，與牙周炎的發生密切相關[11]。牙齦卟啉單胞菌的主要致病力與牙齦蛋白酶、脂多糖、吲哚、有機酸等有關，牙齦卟啉單胞菌介導下的牙周炎性反應是慢性牙周炎的主要發病的可能機制之一[12-13]。本研究結果顯示，慢性牙周炎患者牙齦卟啉單胞菌陽性率為82.0%，顯著高于健康人群牙齦卟啉單胞菌陽性率18.0%，該結果提示慢性牙周炎患者牙齦卟啉單胞菌感染居于較高水平，與文獻報道結果基本一致，應引起重視；牙周健康人群中牙齦卟啉單胞菌陽性率18.0%，提示牙齦卟啉單胞菌感染并非一定會導致慢性牙周炎的發生。據報道[14]，牙齦卟啉單胞菌感染達到一定水平才能引起慢性牙周炎。本研究結果顯示在5 mm、6 mm、7 mm的探診深度時，觀察組牙齦卟啉單胞菌濃度均顯著高于對照組，該結果提示牙齦卟啉單胞菌感染達到一定水平是導致慢性牙周炎的關鍵原因。

NOD樣受體(NLRs)是存在于細胞質中識別病原微生物相關分子模式的模式識別受體，在發生病原微生物感染后會與特定蛋白形成蛋白復合體，在機體免疫反應和疾病發生過程中控制炎性因子的成熟及分泌[15]。NLRP3為NLRs家族的一個重要炎癥復合體，主要由NLRP3的框架蛋白、caspase-1、CARD結構域的凋亡相關顆粒樣接頭蛋白構成，而活化的caspase-1可切割IL-1β與IL-18前體，促進IL-1β與IL-18的成熟及分泌[5]。本研究結果顯示觀察組進行人工牙齦卟啉單胞菌感染的牙周膜細胞的NLRP3、IL-1β與IL-18表達水平顯著高于未進行人工牙齦卟啉單胞菌感染的牙周膜細胞。該結果提示牙齦卟啉單胞菌感染可以導致牙周膜細胞中NLRP3表達增加，進而促進了炎癥反應的發生，導致牙周組織發生損壞。

綜上所述，慢性牙周炎患者牙齦卟啉單胞菌陽性率及感染濃度均處于較高水平，牙齦卟啉單胞菌感染致慢性牙周炎發患者的牙周膜細胞的NLRP3、IL-1β與IL-18表達水平較高，這可能是牙齦卟啉單胞菌感染致患者慢性牙周炎發病的機制之一。