抗突變型瓜氨酸波形蛋白抗體對類風濕關節炎的診斷價值

蔡艷娟，杜娟，盧小嵐，王強,2，凡瞿明，王東生

(1.川北醫學院附屬醫院檢驗科；2.川北醫學院醫學檢驗系，四川 南充 637000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關節炎癥導致的關節損傷和功能喪失為主要表現的最常見的自身免疫疾病之一，在世界范圍內發病率約1%，在我國發病率為0.3%～0.6%。部分RA患者在發病2年即可出現不可逆轉的骨關節破壞而致關節畸形，進而喪失運動能力[1-2]。因此，早期診斷及盡早采取適宜的治療，對于預防關節的損傷非常重要。

類風濕因子(rheumatoid factor，RF)和抗環瓜氨酸肽(anti-CCP)抗體作為重要的實驗診斷指標被列入2009年10月美國風濕病學會(ACR)聯合歐洲抗風濕病聯盟(EULAR)新公布的RA診斷標準中[3-4]。近年來，研究[5-6]發現抗突變型瓜氨酸波形蛋白(anti-MCV)與RA密切相關。本研究采用全自動酶聯免疫法檢測血清中抗MCV，并與抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA作對比分析，探討抗MCV在診斷RA的應用價值。現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 RA組 2017年4月至2017年6月就診于川北醫學院附屬醫院風濕血液科門診及住院的RA患者79例(所有患者均符合ACR/EULAR2009的RA診斷標準)。其中，男性21例，女性58例，年齡16～84歲，平均(52.20±14.25)歲。

1.1.2 非RA結締組織病組 同期入院的非RA自身免疫性疾病51例，包括系統性紅斑狼瘡(SLE)16例，未分化結締組織病(UCTD)19例，干燥綜合征(SS)6例，系統性硬化病(SSC)4例，強直性脊柱炎(AS)4例及其他結締組織病2例，均符合國內外相應診斷標準。其中，男性22例，女性29例，年齡37～70歲，平均(45.56±9.79)歲。

1.1.3 正常對照組 同期來川北醫學院附屬醫院進行健康體檢的健康者40例。其中，男性18例，女性22例，年齡25～61歲，平均(45.60±10.67)歲。

1.2 樣本的收集

所有研究對象均采集空腹靜脈血，收集3～5mL于無抗凝劑管中，37℃孵育至血液凝集完全，3 500 r/min離心5 min后取血清，用于檢測血清中抗MCV、抗CCP、RF IgA、RF IgG和RF IgM濃度。

1.3 實驗試劑與儀器

抗MCV、RF IgA和RF IgG的檢測試劑為酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 定量檢測抗MCV試劑盒，購自德國Orgentec公司；其檢測儀器為德國Orgentec公司Alegria全自動酶聯免疫分析儀。抗CCP的檢測試劑為抗環瓜氨酸肽抗體CMIA試劑盒，購自美國雅培公司；其檢測儀器為雅培化學發光分析儀i2000SR。RF IgM采用速率散射比濁法檢測，其檢測儀器為美國Beckman-Coulter公司的Immage 800雙光徑免疫濁度分析儀，其檢測試劑為Beckman-Coulter公司配套的RF IgM檢測試劑盒。

1.4 測定方法

1.4.1 血清抗MCV、RF IgA和RF IgG的測定 采用Orgentec Alegria全自動酶聯免疫分析儀檢測血清中抗MCV、RF IgA和RF IgG的含量。嚴格按儀器SOP操作規程上機檢測。

1.4.2 血清抗CCP的測定 采用化學發光法檢測血清中抗CCP的含量。嚴格按照雅培I2000SR全自動化學發光免疫分析儀的操作程序來檢測樣本。

1.4.3 血清RF IgM的測定 采用速率散射比濁法檢測血清中RF IgM的含量。嚴格按照Immage 800雙光徑免疫濁度分析儀的操作程序來檢測樣本。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。計量資料均采用表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析；采用受試者工作特征(ROC)曲線評價抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的診斷效能，曲線下面積比較采用Ζ檢驗；采用四格表計算抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA單獨及其聯合檢測在診斷RA的靈敏性(Sen)、特異性(Spe)；RA組抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA的陽性率比較采用配對設計χ2檢驗；多組間百分率的比較采用χ2檢驗；抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA之間的相關性采用Pearson相關分析；以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA含量水平比較

采用全自動酶聯免疫分析法測定血清中抗MCV，化學發光法測定抗CCP，發現RA組患者血清中抗MCV和抗CCP分別為(451.07±40.38)IU/mL、(102.65±9.36)U/mL，較非RA自身免疫性疾病組和正常對照組顯著升高(P<0.01)；但非RA自身免疫性疾病組與正常對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。采用速率散射比濁法檢測血清中RF IgM，全自動酶聯免疫分析法測定RF IgG和RF IgA，結果顯示：與正常對照組相比，RA組和非RA自身免疫性疾病組患者血清中IgM、IgG、IgA型RF的含量均明顯升高(P<0.01，P<0.05)；而非RA自身免疫性疾病組比較，RA組RF IgM、RF IgG和RF IgA的含量顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組抗MCV、抗CCP和RF IgM含量水平的比較

*P<0.05，**P<0.01，與對照組相比； #P<0.01，與AID組相比

2.2 抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的ROC曲線分析

以RA組、非RA自身免疫性疾病組和正常對照組來制作抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA診斷RA的ROC曲線，見圖1。據ROC曲線取得抗MCV、抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA診斷RA的最佳閾值分別為54.05 IU/mL、3.45 U/mL、25.35 IU/mL、19.95 U/mL、17.00 U/mL；診斷靈敏度分別為：0.931、0.897、0.873、0.782、0.718；診斷特異性分別為0.870、0.846、0.459、0.596、0.702。其中，ROC曲線確定抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的最佳閾值與試劑說明書給出的參考值范圍相近，而抗MCV的最佳閾值卻高出試劑說明書提供的參考值范圍，因此本文采用ROC曲線確定抗MCV的最佳閾值作為陽性閾值。

比較這5個指標的ROC曲線下面積可知，抗MCV的ROC曲線下面積最大，為0.960；然后依次是抗CCP、RF IgM、RF IgA和RF IgG，其曲線下面積分別為0.935、0.780、0.738、0.736。經Z檢驗統計分析，抗MCV的曲線下面積與RF IgM、RF IgG、RF IgA比較，差異有統計學意義(Z=3.713，Z=4.711，Z=4.580，P<0.05)；與抗CCP相比，RF IgM、RF IgG、RF IgA的曲線下面積變小，差異有統計學意義(Ζ=3.067，Ζ=4.008，Ζ=3.898，P<0.05)；而抗MCV與抗CCP、RF IgM與RF IgG、RF IgA間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA在RA組中陽性率比較

比較RA組病例抗MCV陽性檢出率與抗CCP、RF IgM、RF IgG和RF IgA的差異發現，抗MCV抗體陽性率明顯高于RF IgM、RF IgG和RF IgA(P<0.05)；但與抗CCP抗體的陽性率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表3。

表2抗MCV、抗CCP、RFIgM、RFIgG和RFIgA的ROC曲線分析結果

項目最佳閾值敏感性(%)特異性(%)AUCSEAUC的95%CI抗MCV54.0589.8791.210.9600.0180.925～0.994抗CCP3.4584.8184.610.9350.0230.891～0.980RF IgM25.3578.4846.150.780?#0.0450.692～0.868RF IgG19.9574.6859.340.736?#0.0440.650～0.822RF IgA17.0072.1570.320.738?#0.0450.650～0.826

注：經Z檢驗，兩兩比較。*P<0.05，與抗MCV比較；#P<0.05，與抗CCP比較。

表3RA組病例中抗MCV與抗CCP、RFIgM、RFIgG、RFIgA的陽性率比較

項目抗CCP+-RF-IgM+-RF-IgG+-RF-IgA+-合計抗MCV +65661105813561571 -261717178合計671262175920572279χ2值1.1255.8188.64310.562P值0.2890.0120.0020.001

2.4 RA患者中抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA間相關性分析

對RA組病例中抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA進行Pearson相關性分析發現，抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA間均有相關性(P<0.05)；其中，抗MCV與抗CCP的相關性(r=0.430，P=0.000)較與其他3項指標的相關性更大。見表4。

表4RA病例中抗MCV與抗CCP、RFIgM、RFIgG、RFIgA間相關性分析

項目抗CCPRF IgMRF IgGRF IgA抗MCVr值0.4300.2720.2690.343P值0.0010.0160.0170.002

2.5 抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA聯合檢測的診斷效能分析

根據抗MCV、抗CCP、RF的敏感性和特異性不同，進行兩兩聯合和全部聯合檢測，分析比較其診斷效能發現：抗MCV/抗CCP/RF IgM/RF IgG/RF IgA聯合檢測診斷RA的敏感性最高，為98.73%，但敏感性和準確性最低，分別為56.04%，75.88%；抗MCV/抗CCP聯合檢測的敏感性最低為92.40%，但特異性和準確性最高，分別為90.11%及91.18%。見表5。

表5抗MCV與抗CCP、RFIgM、RFIgG、RFIgA聯合檢測的診斷效能比較(%)

項目敏感性特異性準確性陽性似然比陰性似然比抗MCV/抗CCP92.4090.1191.1889.0291.11抗MCV/RF IgM/RF IgG/RF IgA96.2062.6478.2469.0991.94抗CCP/RF IgM/RF IgG/RF IgA94.9360.4476.4767.5790.16抗MCV/抗CCP/RF IgM/RF IgG/RF IgA98.7356.0475.8866.1094.44

3 討論

目前，類風濕關節炎的診斷主要依靠臨床表現、血清學指標、X線改變；RF和抗CCP是目前最常用且最重要的血清學指標[3-4]。RF是一種抗自身變性IgG分子Fc段的自身抗體，常與自身IgG分子結合形成穩定的免疫復合物，沉積于關節內，引起關節損傷；或者沉積于血管壁，激活補體引起壞死性血管炎等[7-8]。血清中RF主要為IgM、IgG和IgA型RF，其含量水平高低與RA的病情活動性、病情進展程度及預后密切相關。雖然RF對RA有一定的相關性和較好的敏感性，但其可出現于許多非RA結締組織病、部分腫瘤以及感染患者中，甚至出現于一些正常老年人中，特異性不高，限制了其臨床應用。抗CCP是目前廣泛用于RA診斷的血清學指標。近年來，研究[9-10]發現抗CCP不僅在RA的診斷中有較高的敏感性和特異性，還與RA疾病活動程度以及關節侵蝕之間存在顯著的相關性；而且，抗CCP在未分化關節炎患者未來是否發生RA具有一定的預測價值[11]。

波形蛋白是一種重要的細胞骨架蛋白，它與微管、微絲等在細胞內形成了一個完整的細胞支撐網絡體系。波形蛋白在凋亡細胞內經由肽酰精氨酸亞氨酶(PAD)的瓜氨酸化，精氨酸被修飾為瓜氨酸，這就改變了原波形蛋白結構變成突變型波形蛋白(mutated citrullinated vimentin，MCV)。MCV在凋亡細胞內因得不到及時清除而導致瓜氨酸波形蛋白的持續存在，進而促進了抗MCV抗體的產生。抗MCV與抗CCP抗體有共同的抗原決定簇(與RA相關的靶抗原：瓜氨酸)，在化學結構上具有相關性[5,12-13]。因此，抗MCV作為RA新的特異性抗體逐漸成了研究熱點。

本研究結果顯示，RA組患者血清中抗MCV含量明顯高于非RA自身免疫性疾病組和正常對照組，與何東儀等[14]報道的RA患者血清抗MCV水平一致。通過ROC曲線分析發現，抗MCV診斷RA的最佳閾值為54.05 IU/mL；其ROC曲線下面積為0.940，較RF IgM(AUC=0.780)、RF IgG(AUC=0.736)、RF IgA(AUC=0.738)明顯增加(P<0.05)，但與抗CCP(AUC=0.925)比較，差異無統計學意義。這表明抗MCV對RA的診斷價值與抗CCP相當，但要明顯優于RF IgM、RF IgG和RF IgA。

本研究發現抗MCV診斷RA的靈敏度和特異性分別高于抗CCP。分析原因可能是：首先，抗MCV 的抗原來源于天然蛋白，具有多個潛在的抗原決定簇；而抗CCP的是人工合成的，僅有1～2個潛在抗原決定簇；因此，抗MCV較抗CCP具有更高的特異性和敏感性[12-13]。其次，本研究采用了ROC曲線確定抗MCV的最佳閾值作為陽性閾值，而非試劑盒提供的參考值。再次，在既往研究中采用手工操作酶聯免疫測定血清抗MCV，其操作過程復雜，影響因素較多，而本研究中采用的是全自動酶聯免疫分析儀來測定，檢測結果客觀，重復性好，影響因素少。另外，抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA聯合檢測，可進一步提高診斷RA的敏感度，降低漏診率；這對于RA的早期診斷、早期規范治療、控制病情、減輕骨關節損壞程度，進而改善預后具有至關重要的作用。

本研究同時對RA組病例中抗MCV與抗CCP、RF IgM、RF IgG、RF IgA分別進行了相關性分析，結果發現抗MCV與這4項指標間均有相關性(P<0.05)。其中，抗MCV與抗CCP的相關性最大，相關系數為0.430。

綜上所述，抗MCV診斷RA具有較高的敏感性和特異性，且與抗CCP相關性強，可作為診斷RA的輔助指標。抗MCV采用全自動酶聯免疫分析儀檢測操作簡單快捷、客觀、重復性好、易于標準化，具有廣泛的臨床應用前景。