灰樹花β多糖通過激活氧化應激誘導肺癌細胞凋亡

陶佳，牛靜靜，郝世莉，劉家有

(1.川北醫學院基礎醫學院病理學教研室·川北醫學院附屬醫院病理科，四川 南充 637000；2.西安市胸科醫院病理科，陜西 西安 710100；3.重慶市第七人民醫院兒科，重慶 400054；4.川北醫學院基礎醫學院人體解剖學教研室，四川 南充 637000)

肺癌是目前嚴重威脅人類健康的最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位居所有惡性腫瘤首位。盡管聯合使用吉西他濱，紫杉類等新的化療藥物與順鉑是目前治療肺癌的一線治療方案，但是臨床大數據顯示肺癌患者5年生存率仍較低[1]?；覙浠ㄊ且环N食用菌，兼有重要的藥用價值，主要分布于我國浙江，河北，四川，云南，福建等省。近30年來，研究人員從灰樹花子實體和菌絲中提取出近幾十種活性物質，大部分是具有生物活性的多糖物質，包括MD-型、X-型和D-型等。研究[2]發現，灰樹花提取物多糖成分是一種較好的免疫佐劑。Kodama等[3]研究發現，D-Fraction能夠激活巨噬細胞，導致IL-12生成增多。Inoue等[4]研究發現，D-Fraction在調控T淋巴結Th1/Th2的比率方面發揮著重要的作用。近年來，有研究表明灰樹花提取物在抗腫瘤方面發揮著重要的作用。例如，D-Fraction能夠顯著抑制犬癌細胞的生長[5]。在荷瘤小鼠中，灰樹花D-Fraction能夠增強抗腫瘤效應，減弱絲裂霉素誘導的免疫抑制作用[2]。荷瘤小鼠口服灰樹花提取物β-葡聚糖能夠增強系統性抗腫瘤免疫反應，減弱免疫抑制作用[6]。基于此，課題組提出疑問，灰樹花提取物對肺癌細胞的生存與凋亡有無影響？迄今為止，尚未見相關報道。本實驗通過研究灰樹花β-多糖對肺癌細胞的生存與凋亡的影響，明確灰樹花β-多糖具有抑制肺癌細胞生存的特性；并初步探討灰樹花β-多糖誘導肺癌細胞凋亡的分子機制，發現灰樹花β-多糖通過誘發肺癌細胞發生氧化應激，促使胞內活性氧生成增多，最終導致細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌細胞A549和LA795為本實驗室保存的細胞株。F-12K細胞培養液(Invitrogen，美國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，D-Fraction(Mushroom wisdom，美國)，CCK-8，細胞線粒體分離試劑盒(碧云天，中國)，MitoSOX和TMRM染料(Invitrogen，美國)，Annexin-V FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(貝博，中國)，細胞色素c，Bcl-2，Bax，Bak，β-actin，COXⅣ抗體(Abcam，美國)

1.2 細胞培養

用含10%胎牛血清的F12K培養液于37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養肺癌細胞A549和LA795。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力

取處于對數生長期的肺癌細胞接種于96孔板。24 h后，更換培養基，使其含有不同濃度的D-Fraction。后續根據實驗需要，在不同時間節點加入10 μL CCK-8試劑。避光孵育1 h后，在450 nm處檢測光吸收值。每組設8個復孔，實驗重復3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

取處于對數生長期的肺癌細胞接種于6孔板。24 h后，更換培養基，使其含有不同濃度的D-Fraction。48 h后，常規收集細胞。用預冷的PBS緩沖液沖洗兩次，加入400 μL結合緩沖液，重懸細胞。于避光條件下，加入10 μL Annexin V-FITC染料，混勻，4 ℃孵育10 min。加入5 μL PI染料，混勻，4 ℃避光孵育10 min，上機檢測。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.5 MitoSOX檢測線粒體ROS

取處于對數生長期的肺癌細胞接種于共聚焦顯微鏡專用Dish中。24 h后，更換培養基，使其含有不同濃度的D-Fraction。48 h后，用無血清培養基沖洗三次。加入Mito SOX染料，37 ℃避光孵育10 min。棄染液，加入500 μL 無血清培養基覆蓋細胞，于共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。用Image J軟件計算熒光強度。每組3個復孔，每孔隨機拍攝5個視野，實驗重復3次。

1.6 TMRM檢測線粒體膜電位

取處于對數生長期的肺癌細胞接種于共聚焦顯微鏡專用Dish中。24 h后，更換培養基，使其含有不同濃度的D-Fraction。48 h后，加入TMRM染料，使其終濃度為100 nM，37 ℃避光孵育30 min。棄染液，加入500 μL 無血清培養基覆蓋細胞，于共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。用Image J軟件計算熒光強度。每組3個復孔，每孔隨機拍攝5個視野，實驗重復3次。

1.7 分離線粒體蛋白

常規收集細胞，用預冷的PBS緩沖液沖洗3次。加入1 mL線粒體分離試劑，懸浮細胞，冰浴15 min。將細胞懸液轉移至玻璃勻漿器中，勻漿約20下。600 g，4 ℃離心10 min。取上清，轉移至新的離心管，11 000 g，4 ℃離心10 min。收集上清即為不含線粒體的胞漿蛋白；收集沉淀即為線粒體。隨后采用細胞裂解液裂解線粒體，即可獲得線粒體蛋白。

1.8 Western Blot

常規收集細胞。用細胞裂解液于冰上裂解細胞，獲得細胞蛋白，用BCA法進行蛋白定量。加入適量5×SDS-PAGE緩沖液，煮沸，變性。后續經SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，封閉，一抗孵育(4 ℃，過夜)，二抗孵育等步驟。最后將PVDF膜置于采集器內，發光，拍照。β-actin為胞漿蛋白內參照，COXⅣ為線粒體蛋白內參照。用Quantity One軟件對條帶進行灰度值分析。實驗重復3次。

1.9 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件分析。多組數據分析采用方法檢驗，兩組間比較采用非配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 灰樹花β多糖抑制肺癌細胞生長

如圖1所示，灰樹花β多糖處理能夠顯著抑制肺癌細胞的生長。并且，灰樹花β多糖抑制肺癌細胞生長呈劑量依賴性。2.5 μg/mL灰樹花β多糖對肺癌細胞A549的生長抑制率為(35.13±2.89)%，對LA795細胞的生長抑制率為(25.09±3.64)%；與對照組相比，其差異具有統計學意義(P<0.05)。5 μg/mL灰樹花β多糖對肺癌細胞A549的生長抑制率為(45.68±3.81)%，對LA795細胞的生長抑制率為(32.82±3.67)%；與對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。10 μg/mL灰樹花β多糖對肺癌細胞A549的生長抑制率為(54.54±2.14)%，對LA795細胞的生長抑制率為(42.52±2.69)%；與對照組相比，其差異具有統計學意義(P<0.05)。后續實驗中，灰樹花β多糖劑量取5 μg/mL進行研究。

2.2 灰樹花β多糖促進肺癌細胞凋亡

如圖2所示，灰樹花β多糖處理能夠顯著促進肺癌細胞凋亡。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，肺癌細胞A549的細胞凋亡率為(37.80±3.76)%，與對照組(4.30±0.80)%相比，其差異具有統計學意義(P<0.05)。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，肺癌細胞LA795的細胞凋亡率為(40.80±5.81)%，與對照組(4.43±0.78)%相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.3 灰樹花β處理誘發肺癌細胞氧化應激

如圖3所示，灰樹花β多糖處理后，細胞內ROS產生顯著增多。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，肺癌細胞A549的ROS相對水平為(1 299.67±37.21)，與對照組(580.33±17.75)相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，肺癌細胞LA795的ROS相對水平為(1133.00±115.02)，與對照組(513.67±31.33)相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4 灰樹花β處理降低肺癌細胞線粒體膜電位

如圖4所示，灰樹花β多糖處理后，線粒體膜電位顯著降低。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，肺癌細胞A549的線粒體膜電位的相對水平為(399.67±59.87)，與對照組(980.33±64.15)相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，肺癌細胞LA795的線粒體膜電位的相對水平為(299.87±37.21)，與對照組(1007.01±35.39)相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.5 灰樹花β處理促進肺癌細胞Cyto-c從線粒體釋放

如圖5所示，灰樹花β多糖處理促進Cyto-c從線粒體釋放至胞漿。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，Cyto-c在胞漿中的相對表達水平為(0.61±0.04)。與對照組(0.12±0.06)相比，其在胞漿中的相對表達水平顯著升高(P<0.05)。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，Cyto-c在線粒體中的相對表達水平為(0.22±0.05)。與對照組(0.51±0.04)相比，其在線粒體中的相對表達水平顯著降低(P<0.05)。

2.6 灰樹花β處理促進肺癌細胞Bcl-2家族分子發生轉位

如圖5所示，灰樹花β多糖處理促進Bcl-2從線粒體轉位至胞漿；促進Bax和Bak從胞漿轉位至線粒體。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，Bcl-2在線粒體中的相對表達水平為(0.45±0.05)。與對照組(1.01±0.06)相比，其在線粒體中的相對表達水平顯著降低(P<0.05)。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，Bax在線粒體中的相對表達水平為(0.41±0.02)。與對照組(0.12±0.005)相比，其在線粒體中的相對表達水平顯著升高(P<0.05)。5 μg/mL灰樹花β多糖處理48 h后，Bak在線粒體中的相對表達水平為(0.29±0.07)，與對照組(0.05±0.01)相比，其在線粒體中的相對表達水平顯著升高(P<0.05)。

3 討論

灰樹花是一種生長在亞熱帶的大型食用菌，具有重要的藥用價值。別名栗蘑，多葉奇果菌[7]。在日本稱為“舞茸”。自上世紀八十年代以來，研究人員陸續從灰樹花子實體和菌絲中提取出幾十種活性多糖成分，包括MD-型，X-型，和D-型等。D-Fraction主要由兩種葡聚糖組成，包括：以β-(1-6)結合為主鏈，β-(1-3)結合為側鏈的葡聚糖和以β-(1-3)結合為主鏈，β-(1-6)結合為側鏈的葡聚糖。研究發現，灰樹花提取物多糖成分具有較強的生物調節活性。它在免疫調節，抑制腫瘤發生發展，拮抗HIV病毒，血糖血壓調節，調控脂肪代謝等方面發揮著重要的作用。在胰島素抵抗的KK小鼠中，X-fraction能夠調控葡萄糖/胰島素代謝，其機制可能是通過增強外周胰島素敏感性[8]。在2型糖尿病小鼠KK-Ay中，MT-α-葡聚糖通過與胰島素受體相互作用抵抗糖尿病[9]。此外，灰樹花多糖活性成分在血壓調節方面發揮著重要的作用。研究發現，2型糖尿病小鼠口服灰樹花多糖成分SX-fraction能夠顯著降低收縮壓和空腹血糖[10]。載體蛋白E敲除小鼠口服灰樹花提取物后，血清總膽固醇水平顯著降低，表明灰樹花提取物能夠抑制動脈粥樣硬化的發展[11]。Lin等[12]研究發現MD-Fraction以劑量依賴的方式作用于造血骨髓干細胞，促進骨髓干細胞的生長和分化。此外，灰樹花活性成分在免疫調節方面也發揮著重要的作用。Kubala等[13]研究發現，D-葡聚糖能夠激活血液吞噬細胞和淋巴細胞，具體表現為：血液中ROS水平升高，促炎因子IL-6，IL-8，TNFα水平升高。Kodama等[3]研究發現，D-Fraction通過激活巨噬細胞，促進IL-12生成增多，最終導致NK細胞殺傷活性增強。

本研究發現，D-Fraction處理能夠顯著抑制肺癌細胞生長，促進肺癌細胞凋亡。Kodama等還發現，D-Fraction通過激活巨噬細胞，樹突細胞，和T細胞，抑制腫瘤細胞生長。Konno[5]的研究結果表明D-Fraction能夠有效的抑制犬癌細胞生長或直接殺死癌細胞。在荷瘤小鼠模型中發現，口服D-Fraction或腹腔注射D-Fraction均能夠抑制腫瘤生長[6]。Shomori等[14]研究發現灰樹花提取物能夠顯著抑制胃癌細胞生長，促進胃癌細胞凋亡。D-Fraction聯合化療藥物絲裂霉素能夠抑制腫瘤細胞生長[2]。近年來，灰樹花提取物抑制腫瘤生長是否依賴于免疫系統的激活仍存在分歧。Sanzen等[15]研究結果發現，D-Fraction以依賴激活巨噬細胞的方式抑制肝癌細胞Huh-1生長。與Sanzen等研究結果一致，Masuda等[16]研究結果表明，MD-Fraction通過激活NK細胞和抗原呈遞細胞，抑制胞內粘附分子(intracellular adhesion molecule，ICAM-1)，最終抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。然而，Aloso等[17]研究發現，D-Fraction以不依賴于免疫系統的方式，直接作用于腫瘤細胞，并能夠顯著降低腫瘤細胞活力，降低乳腺癌細胞的遷移和侵襲活性，最終導致細胞侵襲性行為減弱。并且，D-Fraction能夠顯著降低荷乳腺癌小鼠的腫瘤負荷和肺轉移的轉移灶數目。本次研究結果與Aloson等的研究結果一致，顯示D-Fraction能夠直接作用于肺癌細胞，抑制肺癌細胞生長，促進肺癌細胞凋亡。

研究結果表明，D-Fraction能夠誘發肺癌細胞發生氧化應激，主要表現為細胞內活性氧產生顯著增多，線粒體膜電位降低，細胞色素c從線粒體釋放至胞漿，Bcl-2從線粒體外膜轉位至胞漿，Bax和Bak從胞漿轉位至線粒體外膜，最終導致肺癌細胞凋亡。Shomori等發現，灰樹花提取物處理胃癌細胞后，胞漿細胞色素c水平顯著升高，caspase 3和ADPR活化形式水平顯著升高，而p21和Bax的水平不變，細胞發生凋亡。Soares等[18]研究發現，D-Fraction通過上調Bax基因表達，誘導乳腺癌細胞凋亡。近年來，有研究報道D-Fraction也能夠通過調控血管生成發揮抗腫瘤作用[19]。Sanzen等研究表明，D-Fraction處理能夠激活巨噬細胞，導致一氧化氮合酶介導的一氧化氮合成增多，抑制肝癌細胞生長。以上研究表明，灰樹花提取物D-Fraction在多種惡性腫瘤細胞中均能誘導細胞凋亡，但誘導細胞凋亡的作用機制不盡相同，這可能與細胞類型及細胞所處的環境有關。

總之，本研究首次報道了灰樹花提取物D-Fraction能夠抑制肺癌細胞生長，促進肺癌細胞凋亡。其機制可能是通過誘發肺癌細胞發生氧化應激，促使細胞內活性氧生成增多，線粒體功能受損，最終導致細胞凋亡。