抗炎及抗自由基治療對腦缺血/再灌注后成年大鼠神經干細胞增殖及BDNF和VEGF表達的影響

張小東，王藝蓉，賀詩佳，謝鵬

(1.川北醫學院附屬醫院神經內科，四川 南充 637000；2.重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科，重慶 400016)

缺血性卒中是一種高發病率、高致殘率和高死亡率的常見病和多發病。目前神經保護治療是近年尚在試驗的一種重要治療措施[1]。目前，國內外有關抗炎和抗自由基治療對內源性神經干細胞增殖和神經生長因子的影響情況報道較少[2]。本研究通過建立大鼠大腦中動脈缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)，觀察環磷酰胺(Cyc)、秋水仙堿(Col)和維生素C(VitC)對神經干細胞增殖和腦源性神經生長因子(brain derived neurotrophic growth factor，BDNF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠140只，由重慶醫科大學動物實驗室提供，體質量180～200 g。給予大鼠12 h的光照/黑暗循環，并可以自由獲取食物和水。

1.2 主要試劑

Brdu購自Sigma公司，小鼠抗大鼠Brdu單克隆抗體、兔抗大鼠Nestin多克隆抗體、兔抗大鼠BDNF多克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒(SA1021和SA1022)、原位雜交試劑盒及DAB顯色劑購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.3 MCAO模型的建立

采用線栓法制備右側大腦中動脈局灶腦缺血模型[3]，缺血2 h誘導缺血再灌注。假手術組進行類似的手術，但植入線栓后立即摘除燈絲(無阻塞，無再灌注)。行為學評分參照文獻5分制標準，評分≥2分者為造模成功[4]。

1.4 動物分組

140只模型大鼠隨機分為5組：單純局灶缺血/再灌注組(I/R 組)、局灶缺血/再灌注+Cyc和Col(CC 組)、局灶缺血/再灌注+Col(Col 組)、局灶缺血/再灌注+VitC組(VitC 組)和假手術組(SC組)，每組28只。各種藥物的給藥途徑分別為：Cyc：5 mg·100 g-1·d-1，用1 mL生理鹽水溶解后腹腔注射；Col：10 μg·100 g-1·d-1，用1 mL生理鹽水溶解后灌胃；VitC：5 mg·100 g-1·d-1，用1 mL生理鹽水稀釋后腹腔注射；SC組：用1 mL生理鹽水腹腔注射。各組均每天給藥1次，連續10 d。各組分別在給藥后1、3、7、10、14、21和28 d時處死大鼠4只。處死大鼠前1 d ，每只大鼠腹腔注射Brdu，50 mg/kg，用生理鹽水1 mL稀釋后注射，1次/8 h，共3次。

1.5 取材

實驗動物達到觀察時相點時，用3.5%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛緩沖液(含1‰ DEPC)心臟灌注，斷頭取腦，放入4%多聚甲醛緩沖固定液(含1‰DEPC)中固定30～40 min。然后梯度酒精脫、浸蠟，石蠟包埋，切片(厚度6 μm)。取材部位：室管膜下區(Subventricular zone，SVZ)(A-P坐標，bregma -0.30～-1.2 mm)、海馬齒狀回(subdentate gyrus zone，SGZ)(A-P坐標，bregma -4.5～-3.14 mm)及缺血周邊區。

1.6 Brdu、Nestin、VEGF和BDNF陽性細胞的檢測

石蠟切片常規脫蠟至水，室溫下加入復合消化酶孵育10 min；蒸餾水沖洗3次，5 min/次，加入50%甲酰胺/2×SSC，65 ℃孵育2 h；2×SSC沖洗3次，5 min/次，加入2 N/L，37 ℃孵育30 min；0.01 MPBS沖洗3次，5 min/次，0.1 M硼酸(pH=8.5)室溫下孵育10 min；0.01 MPBS沖洗3次，5 min/次，加入1%過氧化氫，室溫下孵育15 min；0.01 MPBS沖洗3次，5 min/次，加入封閉液，室溫下孵育2 h；加入小鼠抗大鼠Brdu(1∶100稀釋)，4 ℃過夜， 37 ℃復溫40 min；0.01 MPBS沖洗3次，5 min/次；再加入生物素化山羊抗小鼠IgG，25 ℃孵育2 h；0.01 MPBS沖洗3次，5 min/次，SABC室溫下孵育2 h；0.01 MPBS沖洗×3次，5 min/次，DAB顯色7 min，顯微鏡下觀察終止顯色；蘇木素輕度復染。二甲苯透明，封片。Nestin和BDNF陽性細胞檢測參照免疫組化SABC法的操作步驟，原位雜交檢測VEGFmRNA，按原位雜交檢測試劑盒操作步驟進行，DAB顯色，蘇木素復染。VEGF的mRNA探針序列為：(1)5’-GCTCTACCTCCACCATG CCAAGTG GTCC CA-3’；(2)5’-GACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAG TACCC-3’；(3)5’-GCAGC TTGAG TTAAACGAACGTACTTGCAG-3’。

Brdu和Nestin陽性細胞計數部位為SVZ和SGZ。BDNF和VEGF陽性細胞計數部位為海馬和缺血周邊區。每只動物每個指標的每個部位各選取切片1張，選擇5個視野(10×40倍)，Olympus BX14型生物醫學圖像分析系統進行分析，以細胞內出現棕黃色顆粒者為陽性。計數每個視野的陽性細胞后，計算每只鼠所要分析部位的平均陽性細胞數，再在同一組之間取平均值。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠Brdu和Nestin的表達

I/R后SVZ和SGZ較SC組Brdu和Nestin陽性細胞計數均明顯增多，差異均有統計學意義(P<0.05)。Brdu的表達高峰期在7 d與28 d降至正常。Nestin的表達高峰期在10 d。CC組與I/R組比較，Brdu和Nestin陽性細胞數的減少具有統計學意義(P<0.05)；Col和VitC組兩個部位各自陽性細胞計數的組間統計結果，與SC組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而與單純I/R組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖1和圖2。

表1I/R后不同時間點SVZ和SGZ處Brdu陽性細胞數

2.2 各組大鼠BDNF的表達

I/R后海馬和缺血周邊區的BDNF表達增強，表達高峰期均在7 d，與SC組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。CC組與I/R組比較，陽性細胞數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)；Col或VitC組較SC組表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)；而與I/R組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3及圖4。

2.3 VEGF的表達

I/R后海馬區和缺血周邊區的VEGF的mRNA表達增強，海馬的表達高峰期在7 d，而缺血周邊區的表達高峰期在1 d，與SC組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。CC組與I/R組比較，陽性細胞數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)；Col或VitC組較SC組表達增加，差異有統計學意義(P<0.05)；而與I/R組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5-圖7。

3 討論

腦缺血使缺血中心區細胞壞死，產生神經功能缺損；同時也啟動了機體的自身保護和修復機制，如缺血后，對神經細胞有保護作用的BDNF[5]分泌增加，誘導神經干細胞的增殖[6]。同時腦缺血也激發PER血管的再生，如缺血后VEGF表達明顯增多[7]。VEGF具有神經保護和神經營養作用，特異性地促進血管內皮細胞有絲分裂、調節血管生成，并可獨自誘導新生血管形成[8]。腦缺血后的這些反應是恢復期腦功能代償最重要的物質結構基礎。

本實驗選用了抗炎治療藥物Cyc和Col以及抗自由基治療藥物VitC，發現Cyc和Col聯合作用對缺血再灌注大鼠神經干細胞的增殖和血管及神經生長因子的產生有抑制作用，而單獨應用Col對缺血再灌注大鼠神經干細胞的增殖和血管及神經生長因子的產生既無明顯促進作用也無明顯抑制作用。既往研究發現VitC對發育中的腦組織[9]和體外培養的神經細胞的生長有促進作用[10]，能夠減少自由基，具有抗氧化損傷的作用，但本研究卻發現VitC對上述有益指標也無促進作用，與既往研究結果不一致。可能的原因與抗自由基藥物的選擇單一有關，后續的研究應聯合超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、別嘌醇等多種抗自由基藥物進行對比研究。

近年來對缺血性腦血管疾病的治療做了大量深入的研究，但這些研究大都是干預缺血后的病理生理過程[11-12]。缺血會引起腦水腫、鈣超載、局部的炎性反應、神經細胞凋亡增加、興奮性氨基酸和自由基增多等[13]。針對這個病理生理過程提出了抗腦水腫的治療和鈣拮抗劑治療、拮抗興奮性氨基酸介導的毒性作用、抗炎治療等神經保護治療措施[14]。但按照該理論所形成的治療體系，目前卻未能夠較大地推動缺血性腦血管疾病的治療進展，缺血性腦血管疾病臨床療效仍較差[15]。既往動物實驗證明有效的急性卒中神經保護劑應用于臨床未能發揮神經保護作用[16-17]：部分原因可能是其僅僅延緩了缺血區神經細胞的死亡，卻不能最終阻止神經元的死亡，也有可能是挽救成功的瀕死神經細胞，不一定能夠發揮正常功能[18]；本研究發現聯合應用Cyc和Col等抗炎治療藥物對干細胞和血管的增殖不利，故推測另外一個可能的原因是神經保護劑未能促進急性期所啟動的神經保護和修復機制，導致遠期療效差。

既往報道Cyc和Col治療急性腦梗塞可以減輕腦水腫，顯著地改善患者的神經功能缺損和預后，同時對缺血神經細胞有保護作用[19]；但有觀點指出治療腦梗塞的藥物早期能夠改善腦功能，部分原因可能是由于減輕了腦水腫，減輕了對周圍組織的壓迫作用，減小了梗死體積，而不是由于神經細胞增殖代償，因為神經細胞增殖、遷移并發揮功能，且進一步與全腦進行功能整合至少應該在恢復期。同時本試驗也提示，干預缺血后的病理生理過程(如抗炎治療)雖然可能減弱某些損害，但同時可能也減弱了腦的自身保護和修復機制，因為該腦缺血過程同時也啟動了腦的自身保護和修復機制。比如腦水腫減輕可能影響細胞因子的釋放，從而阻止細胞因子參與神經細胞的增殖和血管的再生信號傳遞過程[20]，如腦梗死后TNF-α釋放增加，它會加重腦水腫，但是它卻明顯地促進了SVZ處神經干細胞增殖[21]。因此有必要在減少腦缺血反應和促進神經修復之間尋找一個平衡點。