響應面法優化霍山石斛三萜皂苷提取工藝研究

陳乃東，王 成，陳乃富，陳存武，韓邦興，戴 軍，程 浩

(1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012；2.霍山縣天下澤雨生物科技發展有限公司，安徽 霍山 237266)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanneseTang et Cheng)，俗稱米斛，為蘭科石斛屬多年生草本植物[1](P75)，主產于安徽霍山等地，含有三萜皂苷、甾體皂苷及醛類等成分[2]，具有生津益胃、明目強身、抗腫瘤、抗衰老、擴張血管等功效[3-6]，是安徽道地藥材之一。

現代藥理學研究表明，三萜皂苷具有顯著的抗炎、抗病毒、抗衰老、防治心腦血管疾病等藥理活性[7]，截至目前尚無霍山石斛中三萜皂苷提取及含量測定研究的報道。有鑒于此，本研究首先采用Box-Benkhen設計優化獲得霍山石斛中總三萜皂苷的提取條件，采用最佳提取工藝條件，對其根莖葉中總三萜皂苷的含量進行對比研究。研究結果可望為霍山石斛藥材的綜合開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料霍山石斛2018年11月采自霍山縣天下澤雨生物科技發展有限公司太平畈石斛基地，品種經皖西學院陳乃東教授鑒定為霍山石斛(DendrobiumhuoshaneseTang et Cheng)。霍山石斛新鮮全株，洗凈，-50 ℃冷凍干燥至恒重，粉碎，過40目篩，備用。

齊墩果酸標準品(純度≥98%，批號508-02-1，aladin公司)；香草醛(分析純，北京化學試劑公司)；冰醋酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇(色譜純，美國TEDIA公司)；無水碳酸鈉(分析純，天津市北辰方正試劑廠)。

FA-1004型號電子天平(上海精科天平廠)；HR/T20MN型立式高速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)；TU-1901型雙束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制備

精密吸取0.1 mg/mL標準齊墩果酸甲醇溶液0.00 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL分別放入10個刻度試管中，于75 ℃水浴中揮去甲醇，加入新配制的濃度為5%的香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻；60 ℃水浴加熱15 min，取出后立即用流水冷卻數分鐘，搖勻，加入4.0 mL乙酸乙酯稀釋，以不加標準品溶液的平行樣為空白，在554 nm處測定吸光值(A)[8]。以標準齊墩果酸甲醇溶液的濃度(mg/mL)為橫坐標，測定的吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程A= 28.309C-0.03(R2=0.9909)，結果表明齊墩果酸濃度在2～24 ug/mL范圍內呈良好的線性關系。

1.2.2 總三萜皂苷的提取

精密稱取0.5 g干燥至恒重的霍山石斛干粉，一定濃度的甲醇冷凝回流提取過濾獲總三萜皂苷提取液。

1.2.3 總三萜皂苷含量的測定

精密吸取0.2 mL按“1.2.2”方法制備的提取液，按1.2.1所述步驟操作，在554 nm處測定吸光值(A)，代入標準曲線，計算霍山石斛中三萜皂苷的提取得率。

1.2.4 單因素試驗

精密稱取0.5 g干燥至恒重的霍山石斛干粉若干份，按表1的設計進行單因素實驗，依次考察甲醇濃度、提取次數、提取時間、提取溫度、液料比對霍山石斛三萜皂苷提取得率的影響，當考察其中一個因素時，其他因素均取表1所述的第3水平。實驗設三個重復。

表1 單因素實驗設計表

1.2.5 響應面法試驗因素水平設計

結合單因素試驗結果，選擇以溶劑濃度(A)、提取次數(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)、液料比(E)作為相應變量，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，編碼水平為-1，0和1，且分別以三萜皂苷提取得率(Y)作為響應值，設計5因素3水平響應面法優化提取工藝，實驗因素水平編碼見表2。

表2 實驗因素水平編碼表

1.2.6 數據分析

使用軟件Design Expert 10.0對響應面法設計實驗的結果進行分析，確定霍山石斛三萜皂苷的最佳提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 甲醇濃度對霍山石斛總三萜皂苷提取得率的影響

由圖1-1可知，當甲醇濃度在0%～75%變化時，三萜皂苷的提取得率逐漸增加，當甲醇濃度為75%時，三萜皂苷提取得率達到最大，之后甲醇濃度的增加，三萜提取得率反而下降，可能是因為甲醇濃度的增加，使雜質的溶出加大，阻礙的三萜皂苷的溶出，因此，實驗選擇甲醇濃度0%～50%作為優化提取范圍。

2.1.2 提取次數對霍山石斛總三萜皂苷提取得率的影響

從圖1-2可知，當提取次數在1～3次變化，三萜皂苷提取得率顯著增加；當提取次數大于3次時隨著提取次數增加，三萜皂苷提取得率的變化趨于平緩，繼續增加提取次數的意義不大，因此，實驗選擇提取次數為2～4次作為優化提取范圍。

2.1.3 提取時間對霍山石斛總三萜皂苷提取得率的影響

從圖1-3可知，當提取時間在0.5～2 h變化，三萜皂苷提取得率增長迅速；當提取次數為2～4 h時，三萜皂苷提取得率的變化趨于平緩，提取時間較短時，提取可能不充分，因此提取得率較低，隨著提取時間的增加，三萜皂苷的溶出已達限度，因此，從提高效率的角度考慮，實驗選擇提取時間為0.5～2 h作為優化提取范圍。

2.1.4 提取溫度對霍山石斛總三萜皂苷提取得率的影響

從圖1-4可知 ，當提取溫度在20～80 ℃變化，三萜皂苷提取得率逐漸增加 ；溫度越高，提取得率越大，但80 ℃以后，隨著提取溫度的增加，可能會有部分三萜皂苷因高溫而分解，因此，實驗選擇提取時間為40～80 ℃作為優化提取范圍。

2.1.5 液料比對霍山石斛總三萜皂苷提取得率的影響

從圖1-5可知，當液料比在10∶1～50∶1變化時，三萜皂苷提取得率逐漸增加，當液料比較小時，溶劑較少，因此，提取得率較小，隨著溶劑增加，溶劑與物料接觸很充分，但物料中三萜皂苷的溶出會達到上限，因此，實驗選擇液料比20∶1～40∶1作為最佳優化提取范圍。

圖1 單因素實驗結果

2.2 響應面法實驗結果及數據分析

2.2.1 模型建立與顯著性考察

采取Design-Expert 10.0.4軟件對單因素實驗所得數據進行分析，表3為通過軟件分析之后得到的對霍山石斛提取的五因素三水平實驗設計及各實驗條件下的霍山石斛總三萜皂苷提取得率。

2.2.2 響應面分析

依據表4的結果，利用Design-Expert 10.0.4進行回歸分析，得到霍山石斛三萜(Y)與甲醇濃度(A)、次數(B)、時間(C)、溫度(D)、液料比(E)多元非線性回歸方程：

利用Design-Expert 10.0.4軟件，將46個試驗點的總三萜皂苷提取得率輸入，得到霍山石斛總三萜皂苷提取最佳工藝條件為甲醇濃度35%，次數4次，提取時間1.5 h，溫度64 ℃，液料比30∶1。

表3 響應面法優化試驗設計及結果

從表4回歸模型的方差分析顯著性檢驗看，因素的一次項(A、B、C、D、E)，因素的二次交互項(CD、BE)，二次項 (A2、B2、C2、D2E2)，對三萜皂苷提取得率的影響是顯著的(P<0.05)，其余一次項和二次項交互項對結果影響不顯著(P>0.05)。 在本實驗設計范圍內，該模型的P值為0.0001；說明模型的回歸極顯著；模型的相關系數為0.9614，說明該模型能解釋96.14%響應值的變化，即該模型與實際實驗擬合良好，也證明了響應面法優化霍山石斛三萜皂苷的提取工藝是可行的。

表4 回歸模型顯著性檢驗結果

注：*p<0.05，差異顯著；**p<0.01，差異極顯著。

2.3 響應面優化分析圖

為了更直觀地表現對提取得率的影響較為顯著的二次交互項CD、BE的對霍山石斛總三萜皂苷提取的影響，繪制兩因素交互作用的響應面圖(圖2、圖3)，可見，甲醇濃度(E)與時間(B)，次數(D)與溫度(C)的交互作用對三萜皂苷的提取得率的影響是顯著的。

圖2 甲醇濃度和時間對總三萜皂苷提取得率影響的響應面

圖3 次數和溫度對總三萜皂苷提取得率影響的響應面

圖2為其他因素在一定水平，固定時間不變時，三萜皂苷的提取得率隨著甲醇濃度的增大呈現先升后降的趨勢；當甲醇濃度較大時，三萜皂苷的提取得率隨著時間的增加呈現先上升后平緩下降的趨勢，甲醇濃度較低時，三萜皂苷的提取得率隨著時間的增加快速增加，達到一定值后趨于平緩。從響應面可看出甲醇濃度的上升幅度比時間陡峭，因而甲醇濃度對三萜皂苷的提取得率影響大于時間。

圖3為其他因素在一定水平，固定溫度不變時，三萜皂苷的提取得率隨著提取次數的增大呈現先升后降的趨勢；當提取次數較少時，三萜皂苷的提取得率隨著溫度的增加呈現先上升后平緩下降的趨勢，提取次數較多時，三萜皂苷的提取得率隨著溫度的增加緩慢增加，達到一定值后趨于平緩。從響應面可看出次數的上升幅度比溫度陡峭，因而次數對三萜皂苷的提取得率影響大于溫度。

2.4 驗證實驗

為了對最優提取工藝進行驗證，在甲醇濃度35%，次數4次，提取時間1.5 h，溫度64 ℃，液料比30∶1的條件下進行三組平行重復實驗，最終得到的霍山石斛三萜皂苷的提取得率為3.04%，與預測值差異較小。因此該工藝參數可用來指導霍山石斛三萜皂苷的提取。

2.5 霍山石斛根莖葉總三萜皂苷含量測定

在最佳提取條件下提取條件下對霍山石斛的根，莖，葉分別提取，測定其總三萜皂苷的含量，最終的到三萜皂苷的提取得率分別為3.46%、0.85%、2.47%，通過測定發現霍山石斛葉中三萜含量高于根和莖，此結論對霍山石斛中甾體皂苷的工業化制備提供了理論依據。

3 結論

通過響應面優化法，對提取次數、甲醇濃度、液料比、提取時間、提取溫度這五個因素進行考察，并采用Design-Expert 10.0.4軟件進行分析，通過二次回歸方程，得到的最優提取工藝為甲醇濃度35%，次數4次，提取時間1.5 h，溫度64 ℃，液料比30∶1，在此條件下，霍山石斛三萜皂苷的提取得率為3.04%。

霍山石斛的傳統用藥方式以莖入藥，在采收中，根和葉作為廢棄物直接丟棄，本實驗結果表明，霍山石斛根和葉中總三萜皂苷的含量分別為3.16%和2.47%，中明顯高于莖中的0.85%，該結果可為霍山石斛資源綜合利用提供參考依據。