不同表面滅菌對棉花莖稈內黃萎病菌分離效果的比較

孫 艷，石新建，王振輝，馮麗凱，趙 靜，劉 政

(新疆農墾科學院植物保護研究所，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】棉花黃萎病(cottonVerticilliumwilt)是一種世界性土傳維管束萎蔫病害，近年來在我國主產棉區，尤其是在長江流域、黃河流域和新疆棉區持續暴發為害，發病面積呈現出了高速擴張趨勢，黃萎病的發生為害日趨嚴重，造成嚴重損失[1-3]，加強棉花黃萎病的研究對防治該病有實際意義。 【前人研究進展】棉株體中分離獲得棉花黃萎病菌是開展致病力分化和遺傳變異的基礎，而前人研究結果表明，棉花的根、莖和葉中含有600余種內生菌和病原菌，約29個屬，43個種[4]。分離棉花黃萎病菌時，因為大量棉株樣品在運輸和保存過程中未能及時處理，使得棉株體表面存在大量寄/腐生菌和體內存在大量內生菌而導致后續分離困難，選擇合適的滅菌材料和方法成為影響分離效率的關鍵因素。目前國內外對病原菌輪枝菌的滅菌分離方法均不盡相同，常用的表面消毒劑種類有乙醇、次氯酸鈉和升汞等[5-7]。【本研究切入點】所選用的滅菌劑種類不同，滅菌的時間和方法也各有差異，尤其是在發病棉株材料采集和樣品保存條件差異下，均對病原菌的成功分離有顯著影響。研究篩選一套標準的表面滅菌分離獲得棉稈內黃萎病、病原菌的方法。【擬解決的關鍵問題】根據棉花樣品材料腐爛程度的不同，以最大化分離出黃萎病菌為最終目的。選擇適合的滅菌劑種類和滅菌方法流程。篩選出一套標準的較為適宜的分離棉稈黃萎病菌的滅菌材料和方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

選擇新疆生產建設兵團棉花棉花種植區，一師16團、七師125團、八師142團和新湖農場重度發病棉花莖桿作為供試材料。根據棉稈在運輸保存過程中的腐敗程度，劃分三個等級：Ⅰ、新鮮棉稈(棉稈表皮新鮮，完整；81團五連)，Ⅱ、輕度腐敗棉稈(棉稈表皮輕度變黑褐色，表皮完整；新湖農場)，Ⅲ、重度腐敗棉稈(棉稈表皮完全變黑、腐爛；16團14連)。將供試材料分別用流水反復沖洗，去除棉稈表面雜質。剝皮，切成5 cm左右小段，備用。

選擇性PDA培養基制備：加熱PDA培養基至溶解，冷卻后加入抗生素(鏈霉素：氯霉素：青霉素m/m，1∶1∶1)混合液，分別制備含抗生素濃度100 、200 、300、400和500 mg/L的選擇性PDA培養基。

1.2 方 法

棉花植株體內含有各種細菌和真菌，之間存在共生或拮抗的關系[8]。為排除細菌對分離輪枝菌的潛在影響，配置含不同濃度抗生素混合液的培養基進行抑制細菌試驗。

棉花莖桿內生長多種類型真菌，真菌種類不同，其寄生或共生的部位也不同[9]。試驗用四種不同的表面滅菌方法和滅菌時間處理材料，確定對目標病原菌大麗輪枝菌的最佳分離條件。

將已處理的三個等級的供試材料棉稈，各放入75%的乙醇、0.1%的升汞、5%次氯酸鈉和5%次氯酸鈉+75%乙醇(依次處理)溶液中，分別滅菌處理1、2、3、4和5 min，對Ⅲ型棉稈分別滅菌處理1、2、3、4、5、6、8和10 min無菌水沖洗2次。無菌操作臺內陰干，縱向切取1 cm小段，四等分。

每個處理接種到含500 mg/L抗生素的選擇性PDA培養基中，每個培養皿接種6個棉稈小段，5次重復。10 d統計真菌生長個數和細菌生長個數。

1.3 數據處理

試驗數據為5次重復試驗的平均值取標準差。利用Microsoft Excel 2016軟件進行數據分析和作圖，應用SPSS22統計軟件進行方差分析及LSD檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同抗生素濃度對棉稈內生細菌生長影響

隨著培養基中抗生素濃度的升高，三種棉稈類型分離的細菌生長率均呈下降趨勢。不添加抗生素(0 mg/L)的培養基內，三種棉稈類型的材料細菌生長率均達90%以上，當抗生素濃度為400 mg/L時，Ⅰ型棉稈接種的培養基內無細菌生長，當抗生素濃度為500 mg/L時，三種棉稈類型接種的培養基內均無細菌生長。圖1 用大麗輪枝菌分別接種含抗生素濃度0和500 mg/L PDA培養基，7 d后，該兩個處理間菌落大小無顯著差異。因此，可以確定，含500 mg/L濃度抗生素的PDA培養基對大麗輪枝菌生長無顯著影響，并其對棉稈內細菌抑菌率達100%。后續試驗所有培養基均為含500 mg/L濃度抗生素的PDA培養基。

2.2 不同消毒處理對Ⅰ型棉花莖稈黃萎病菌分離和培養的影響

研究表明,在四種不同的表面消毒處理下，雜菌的生長率隨著處理時間的延長總體呈降低趨勢，處理初期雜菌生長率基本均為100%；而大麗輪枝菌的分離率隨著處理時間延長呈先升高后降低的趨勢，分別在75%乙醇處理4 min、5%NaClO處理3和4 min、0.1%升汞處理1和2 min、75%乙醇+5%NaClO處理4 min時，大麗輪枝菌分離率最高，分別為70%、53.33%、16.67%和70%。圖2

2.3 不同消毒處理對Ⅱ型棉花莖稈黃萎病菌分離和培養的影響

研究表明,4種不同處理方式對Ⅱ型棉稈內真菌分離率的試驗結果與Ⅰ型類似，雜菌生長率隨著滅菌時間的延長而降低，并在處理初期1 min內與對照無顯著差異；大麗輪枝菌的生長率隨著滅菌時間延長呈先升高后降低趨勢，分別在75%乙醇處理4 min、5%NaClO處理3 min、0.1%升汞處理3 min、75%乙醇+5%NaClO處理3 min時分離率最高，分別為90%、76.67%、36.67%和43.33%。圖3

注：差異性顯著(P<0.05)用不同字母標記

Note: Values followed by different lower case letters are significantly different at 0.05 level

圖1 含不同濃度抗生素的PDA培養基對棉稈內生細菌生長抑制
Fig.1 The growth inhibition of bacterial in cotton stalk with different concentration of antibiotics on PDA culture medium

注：不同的大小寫字母分別表示雜菌或大麗輪枝菌之間差異性顯著(P<0.05)。下同

Note: Different upper and lower case letters indicate that there is a significant difference between the contaminating microorganism or theVerticilliumdahiaeKleb (P< 0.05).The same as below

圖2 不同消毒處理下Ⅰ型棉稈內真菌分離率變化

Fig.2EffectsofdifferentdisinfectionmethodsonfungusseparationrateintypeⅠcottonstalk

圖3 不同消毒處理下Ⅱ型棉稈內真菌分離率變化
Fig.3 Effects of different disinfection methods on fungus separation rate in typeⅡcotton stalk

圖4 不同消毒處理下Ⅲ型棉稈內真菌分離率變化
Fig.4 Effects of different disinfection methods on fungus separation rate in typeⅢcotton stalk

2.4 不同消毒處理對Ⅲ型棉花莖稈黃萎病菌分離和培養的影響

研究表明，在四種不同滅菌處理下棉稈雜菌的生長率隨著滅菌時間延長逐漸降低，但是在滅菌處理10 min時，除升汞處理下雜菌生長率10%以外，其余3種滅菌處理的雜菌生長率均在35%以上，且在滅菌初期75%乙醇和5%NaClO處理0～4 min、0.1%升汞處理0～1和2～4 min、75%乙醇+5%NaClO處理0～2和3～6 min彼此均無顯著差異；大麗輪枝菌在四種滅菌處理下分離率總體呈先升高后降低趨勢，分別在75%乙醇處理8 min、5%NaClO處理8 min、0.1%升汞處理5 min、75%乙醇+5%NaClO處理5 min時分離率最高，分別為36.67%、26.67%、30%和50%。圖4

3 討 論

棉花活體植株各個器官的表面或內部均存在各種微生物，如棉花根、葉部位多存在赤霉屬(Gibberella)和青霉屬(Penicillium)，莖部表面多存在鐮刀屬(Fusarium)和鏈格孢屬真菌[10-12]。棉花黃萎病是典型的土傳維管束疾病，輪枝菌多存在于木質部維管束部位[4]。傳統研究中分離黃萎病病原菌的材料，多數采用乙醇、次氯酸鈉和升汞對材料進行表面滅菌，由于材料發病狀況的不同，對其進行滅菌的程序亦不相同[13-14]。研究中，將這3種滅菌方法進行四種不同滅菌組合，在不同的處理時間檢測其對三種材料中目標病原菌的分離情況。結果表明，含500 mg/L混合抗生素的PDA培養基可完全抑制材料中細菌生長。在四種不同表面滅菌處理下，Ⅰ型材料，75%乙醇和75%乙醇+5% NaClO處理4 min時，病原菌的分離率最高，病原菌生長率70%，其中75%乙醇+5% NaClO處理可完全抑制雜菌生長；Ⅱ型材料中75%乙醇處理4 min條件下病原菌分離率最高，為90%；Ⅲ型材料，75%乙醇+5%NaClO處理5 min時分離率最高，為50%。

4 結 論

添加了抑制棉稈內細菌生長的最少混合抗生素(鏈霉素：氯霉素：青霉素 m/m，1∶1∶1)濃度為500 mg/L的PDA培養基；同時根據棉稈腐敗程度的不同，選擇不同的滅菌劑和滅菌時間，即新鮮棉稈材料和輕度腐敗棉稈材料表面滅菌的最佳條件為75%乙醇處理4 min，重度腐敗棉稈表面滅菌條件為75%乙醇+5%NaClO處理5 min。