四種菊科蒿屬植物精油殺螨活性及茵陳蒿揮發油成分分析

趙娜娜，路 偉，傅文佳，古麗米熱·艾買提，杜書亞

(新疆農業大學農學院，烏魯木齊，830052)

0 引 言

【研究意義】2017 年新疆棉花播種面積 228.11 ×104hm2，其種植面積約占全國種植面積的 70% 以上[1]。影響新疆棉花生產的棉花害蟲多達50多種，是導致棉花產量損失的主要原因之一，其中，自20世紀90年代至今，蚜蟲、棉葉螨、棉鈴蟲仍然是影響新疆棉花生產的三大害蟲，未得到有效的控制。土耳其斯坦葉螨是北疆棉花害螨優勢種群[2,3]，據統計，在新疆100×104hm2棉花中, 每年受棉葉螨為害的達53.33×104hm2，絕收1.33×104hm2，棉葉螨使棉花減產達10%～68%，給棉花生產帶來很大的影響[4, 5]。土耳其斯坦葉螨T.turkestani屬真螨目Acariformes、葉螨科Tetranychidae、葉螨屬Tetranychus，主要分布于俄羅斯、哈薩克斯坦、美國、中東和中國等地，在中國僅分布于新疆地區，其他地區還未見報道[6-9]。【前人研究進展】目前國內外防治土耳其斯坦葉螨的主要手段依然是化學防治，主要以有機磷類、新型抗生素類和菊酯類農藥殺螨劑對土耳其斯坦葉螨進行防治，土耳其斯坦葉螨繁殖速率快、世代周期短，短期內對一些常用殺蟲劑可以產生強抗性，也成為制約新疆農業生產發展的關鍵因子[10]。篩選出高效、低毒、對環境友好的新型生物農藥，研究生物殺螨劑對棉葉螨的防治效果和毒力，不僅對棉田殺螨劑的合理使用具有指導意義，還對于園藝植物替代藥劑，綠色產品、無公害產品害螨防治具有參考價值[11]。【本研究切入點】植物源農藥是一類來源于植物體的農藥，其有效成分通常不是單一化合物。因其對環境友好、對非靶標生物安全、不易產生抗藥性、作用方式特異、促進作物生長并提高抗病性、種類多、開發途徑多等特點，在世界范圍內引起廣泛關注[12]。目前，在我國研究比較深入的殺蟲植物中，具有代表性的就屬菊科植物，其中蒿屬植物更是其中的佼佼者之一。蒿屬(Artemisia)是菊科(Compositae)黃春菊族(Anthemideae)的一個大屬，該屬在世界分布約300多種，其中黃花蒿、野艾蒿、毛蓮蒿、豬毛蒿、茵陳蒿、大籽蒿、一枝蒿等具有殺蟲、殺菌的活性，有開發為天然產物的潛力。研究4種蒿屬植物黃花蒿、茵陳蒿、一枝蒿、蔞蒿精油對土耳其斯坦葉螨的生物活性。【擬解決的關鍵問題】通過水蒸氣蒸餾法提取植物精油，葉片浸漬法測定上述4種植物精油對土耳其斯坦葉螨的毒力，評價不同精油對土耳其斯坦葉螨的觸殺活性，為植物源殺螨劑的開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

萎蒿、茵陳蒿、黃花蒿分別采集自江蘇、陜西、河南，一枝蒿采自新疆維吾爾自治區。所有植物標本保存于新疆農業大學農學院昆蟲系天然產物與化學生物學實驗室。

1.1.1 植物

蔞蒿、茵陳蒿、黃花蒿分別采集自江蘇、陜西、河南，一枝蒿采自新疆維吾爾自治區。所有植物標本保存于新疆農業大學農學院昆蟲系天然產物與化學生物學實驗室。表1。

表1 4種植物名錄
Table1 Four plants directory

種類Species拉丁名scientific name科名Family采集部位Source黃花蒿Artemisia annua Linn.菊科全草蔞蒿Artemisia selengensis Turcz.ex Bess菊科全草一枝蒿Artemisia rupestris L.菊科根莖茵陳蒿Artemisia capillaries Thunb.菊科全草

1.1.2 土耳其斯坦葉螨

供試蟲源：土耳其斯坦葉螨于2017年6月采自新疆沙灣縣棉花田的自然種群，采集前棉田未施用任何藥劑。將采集的棉葉螨接到室內種植的盆栽棉花上，等飼養至下一代后再挑選同一批次羽化的成蟲，挑選大小一致的成螨作為試蟲，試蟲不分雌雄。

飼養條件：接種后的盆栽棉花置于人工氣候箱內，氣候箱設置溫度(26～28)℃，相對濕度為75%，光照黑暗時間為14 h∶8 h(L∶D)。

1.1.3 試劑與儀器

儀器：連續蒸餾裝置，北京玻璃儀器廠；DZTW型調溫電熱套，北京市永光明醫療儀器有限公司；SHZ-DIII循環水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器有限責任公司；RE-52CS型號旋轉蒸發器，上海振捷實驗設備有限公司； FA2004N電子天平，天津天馬衡基有限公司；PSX-280H恒溫恒濕箱，寧波萊福科技有限公司。

化學試劑：正己烷、丙酮、無水硫酸鈉(分析純)均購自天津化學試劑公司；聚四氟乙烯購于上海三愛富公司。

1.2 方 法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法提取植物精油

通過水蒸汽蒸餾法提取黃花蒿、茵陳蒿、蔞蒿、一枝蒿精油，提取方法如下：取0.5 kg植物一次全部放入到3 000 mL的圓底燒瓶，加2 000 mL水，用水蒸氣蒸餾法蒸餾3～4 h，所得油水混合物用正己烷萃取，萃取所得物用無水硫酸鈉脫水后，用旋轉蒸發器減壓蒸發濃縮(40℃)回收正己烷，所得殘留的油狀液即為精油，測比重，收集放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 觸殺活性測定

實驗配制濃度為2%的瓊脂，將加熱后的瓊脂倒入12孔的培養板內，瓊脂高度約為0.5 cm，置于-4℃冰箱內備用。將田間采集未施藥劑的新鮮棉花葉片洗凈晾干，用直徑為2 cm的打孔器打孔待備用；以丙酮為溶劑配制2 mL濃度為50%、10%、2%、0.4%的藥劑，棉花葉片在溶液中浸泡10 s后，用鑷子夾出，置于濾紙上自然揮發2 min，然后葉背朝上置于已倒好的瓊脂上，挑取10頭健康一致的成蟲于葉片上，宣紙蓋在培養板上，固體膠封好，置于溫度為25 °C、濕度為70%的溫箱內。24 h后，觀察和記錄試蟲的死亡情況。每個濃度重復5次，每個重復10頭試蟲，丙酮不加藥劑作空白對照。用毛筆撥動蟲體，蟲體不動即為死亡。

根據預實驗的結果，在死亡率為0～100%的濃度范圍內選取6個濃度，方法同預試驗，每個濃度重復5次。

死亡率(%)=100×死蟲數/試蟲數。

校正死亡率(%)=100×[處理組死亡率-對照組死亡率/(1-對照組死亡率)]。

半致死濃度(LC50)即引起50%土耳其斯坦葉螨死亡率的濃度，使用Probit軟件包計算得到半致死濃度。

1.2.3 GC-MS測定精油化學成分

樣品送至北京師范大學分析測試中心。

采用美國Bruker公司450 GC-320 MS三重四級桿氣質聯用儀，配備BP-5MS石英毛細管色譜柱(0.25 μm×0.25 mm×30 m)。EI離子源溫度210℃；傳輸線溫度250℃；進樣口溫度250℃；進樣量1驗μL，分流比1∶10。升溫程序：起始溫度50℃，停留5 min，之后以10℃/min的速率升溫至290℃，停留15 min。

2 結果與分析

2.1 生物活性

研究表明，在藥劑濃度為60.00 mg/mL時，蔞蒿、茵陳蒿、一枝蒿精油的致死率均高達100.00%，黃花蒿的致死率分別為52.00%，活性相對較弱；在濃度為40 mg/mL時，茵陳蒿、一枝蒿、蔞蒿精油的致死率高達90.00%、90.00%、84.00%，黃花蒿的活性較弱，致死率為24.00%；在濃度為26.70 mg/mL時，茵陳蒿、一枝蒿、蔞蒿的致死率分別高達86.00%、80.00%和68.00%，黃花蒿的致死率依然最低為20.00%；在濃度為18.30 mg/mL時，茵陳蒿、一枝蒿精油的致死率分別為48.00%、46.00%，蔞蒿的致死率分別為26.00%黃花蒿的活性較弱，致死率僅為4.00%；在濃度為11.70 mg/mL時，活性較好的茵陳蒿、蔞蒿，致死率分別為18.00%、16%，黃花蒿無活性；在濃度為8.00 mg/mL時，僅有茵陳蒿、一枝蒿有較弱活性，致死率分別為20.00%、16.00%。表2

表2 4種精油處理土耳其斯坦葉螨24 h后校正死亡率
Table 2 Correct mortalityof the four essential oils againstT.turkestaniadults after 24 h(%).

藥劑Species60.00 mg/mL40.00 mg/mL26.70 mg/mL18.30 mg/mL11.70 mg/mL8.00mg/mL黃花蒿52.00±4.90b24.00±2.45d20.00±0.00c4.00±2.45c0.00c0.00c一枝蒿100.00a90.00±3.16a80.00±3.16a46.00±5.10a14.00±4.00ab16.00±4.00ab茵陳蒿100.00a90.00±3.16ab86.00±4.00a48.00±3.74a18.00±3.74a20.00±0.00a蔞蒿100.00a84.00±2.45bc68.00±3.74b26.00±2.45b16.00±6.00a8.00±4.89bc

注：數據為平均值±標準誤，不同小字母表示0.05水平上差異顯著

Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level

研究表明，茵陳蒿、一枝蒿、蔞蒿精油對土耳其斯坦葉螨的觸殺活性較好，LC50分別為17.49、18.17、22.26 mg/mL，與陽性對照除蟲菊提取物觸殺活性(LC50=4.12 mg/mL)相比相差在10倍以內；黃花蒿精油的觸殺活性最弱，LC50為54.00 mg/mL，是陽性對照除蟲菊提取物的13.11倍。表3

表3 4種精油對土耳其斯坦葉螨觸殺活性
Table 3 Contact toxicity of the 4 essential oils againstT.turkestaniadults.

藥劑SpeciesLC50 (mg/mL)95% 置信區間 (mg/mL)95% Confidence intervals (mg/mL)Slope±SE黃花蒿54.0048.20-61.593.703±0.401蔞蒿22.2618.93-27.083.255±0.348茵陳蒿17.4914.17-20.044.232±1.025一枝蒿18.1716.04-20.483.700±0.357除蟲菊提取物4.122.70-6.530.823±0.149

2.2 茵陳蒿精油的化學成分

茵陳蒿精油通過GC-MS檢測并鑒定出33個峰，其中出峰時間在17.46 min時的物質含量最高。研究表明，茵陳蒿精油化學成分及相對含量大根香葉烯 D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)、石竹烯(8.70%)、a-畢橙茄醇(7.03%)、依蘭油醇(4.83%)等。圖1，表4

圖1 茵陳蒿精油離子譜
Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from A.capillaries

3 討 論

菊科植物中有多數高活性植物，其中蒿屬植物更是其中的佼佼者之一，如Tonk等[13](2006)分別提取了黃花蒿的石油醚部分和正己烷部分，并測定黃花蒿提取物對斯氏按蚊3齡幼蟲的生物活性，結果表明，黃花蒿提取物的效果較好。韓小冰等[14](2011)對大籽蒿、黃花蒿、豬毛蒿對舞毒蛾具有較強的觸殺作用。王宇新[15](2009)測定了黃花蒿精油和豬毛蒿精油對玉米象成蟲的生物活性，結果表明，在觸殺活性測定中，0.5 μL/頭處理24 h后，黃花蒿精油和豬毛蒿精油對試蟲的校正死亡率分比為96.66%、97.77%，表現了較高的觸殺活性；在熏蒸活性測定中，兩種精油表現了較高的熏蒸活性，83.33 μL/L處理48 h后，試蟲的校正死亡率均為65%以上；在驅避活性測定中，兩種精油對玉米象成蟲均有良好的驅避作用，8 μL處理24 h后，趨避活性為Ⅳ級。袁海濱等[16](2007)測定了豬毛蒿、黃花蒿、水蒿、大籽蒿4種植物精油對綠豆象成蟲的殺蟲活性，結果表明，這4種植物精油均對綠豆象有較好的熏蒸劑觸殺活性。謝怡孫等[17](2001)測定了蔞蒿精油對菜青蟲具有較強的拒食和胃毒作用。Liu等[18]測定了一枝蒿精油對嗜卷書虱的趨避活性、觸殺活性和熏蒸活性，并以生物測定為指導分離純化出松油醇、乙酸松油脂、4-松油醇和芳樟醇4種活性化合物。茵陳蒿、蔞蒿、黃花蒿、一枝蒿4種蒿屬植物多集中在殺蟲活性方面，還未有文獻報道其殺螨活性。

表4 茵陳蒿精油的化學成分
Table 4 The chemical constituents of the essential oil derived fromA.capillaries(≥1.00%)

序號Number保留時間(RT)Retention Time化合物Compounds相對含量(%)Peak area (%)19.26β-蒎烯 (.beta.-Pinene)1.00310.68羅勒烯(1,3,6-Octatriene, 3,7-dimethyl-)1.00411.67芳樟醇(1,6-Octadien-3-ol, 3,7-dimethyl-)1.30616.67石竹烯(Caryophyllene)8.70716.96(E)-β-金合歡烯( 1,6,10-Dodecatriene, 7,11-dimethyl-3-methylene-, (E)-)1.34817.14α-石竹烯(.alpha.-Caryophyllene)1.19917.34可巴烯(Copaene)3.681017.382-甲基-6-對甲苯基-2-2-庚烯醇(6-(p-Tolyl)-2-methyl-2-heptenol)1.261117.46大根香葉烯 D(1,6-Cyclodecadiene, 1-methyl-5-methylene-8-(1-methylethyl)-, [s-(E,E)]-)16.161217.61聯二苯(Biphenyl)3.181317.641,1-二甲基-二丁基-2,2,3,3-四氟丙基磷酸酯(Phosphoric acid, dibutyl 1,1-dim-ethyl-2,2,3,3-tetrafluoropropyl ester)4.431518.33氧化石竹烯(Caryophyllene oxide)10.421618.65桉油烯醇((-)-Spathulenol)3.301719.41依蘭油醇(tau.-Muurolol)4.831819.55a-畢橙茄醇(.alpha.-Cadinol)7.032019.78環氧異香樹烯(Isoaromadendrene epoxide)1.592220.842-甲基-4-(2,6,6-三甲基環己烯基)2-丁烯-1-醇(2-Methyl-4-(2,6,6-tri-methylcyclohex-1-enyl)but-2-en-1-ol)1.04總含量74.52

根據研究結果表明：茵陳蒿和一枝蒿精油對土耳其斯坦葉螨具有較好的觸殺活性，其LC50值分別為17.49、18.17 mg/mL，活性雖弱于陽性對照，但與陽性對照除蟲菊提取物(LC50=4.12 mg/mL)相比，活性相差在10倍以內，表明茵陳蒿和一枝蒿具有較好的殺螨活性。且有文獻表明茵陳蒿對玉米象有熏蒸活性，其LC50分別是5.31和7.35 mg/L，同時也表現出觸殺活性，其LD50分別是105.95和87.92 μg/頭[19]。表明茵陳蒿精油具有較好的殺螨活性和殺蟲活性，具有發展為天然農藥的潛力。

茵陳蒿A.capillaries為菊科、蒿屬植物，有特異的香氣，味微苦，主產江西、江蘇、安徽、湖北、浙江、陜西、河北、山東等省；為治肝、膽疾患的主要成分，水提取液對多種桿菌、球菌有抑制作用，揮發油有抗霉菌的作用[20]。研究測得茵陳蒿精油的主要化學成分為大根香葉烯 D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)和石竹烯(8.70%)a-畢橙茄醇(7.03%)/依蘭油醇(4.83%)。這幾種主要成分有可能是關鍵的殺螨活性成分，但還有待進一步分離純化，驗證生物活性。關鍵的化學成分則可以殺螨劑的合成提供先導化合物，為植物源農藥的進一步開發應用提供依據。

目前國內外對于植物源藥劑防治棉葉螨的研究較多，大都集中在朱砂葉螨、二斑葉螨的生物活性研究方面，僅有一篇外文文獻報道了迷迭香、薄荷等精油及其主要化學成分對土耳其斯坦葉螨的熏蒸活性[21]。有必要進一步開發植物資源，為土耳其斯坦葉螨的生物防除提供理論依據，為植物源殺螨劑的研制提供技術數據。

4 結 論

4種參試菊科蒿屬植物中，茵陳蒿、一枝蒿、蔞蒿精油對土耳其斯坦葉螨具有較好的觸殺活性，其中茵陳蒿的活性最好，稍弱于除蟲菊提取物，有發展為天然殺螨劑的潛力。茵陳蒿精油通過氣相色譜-質譜聯用儀分析，主要成分為大根香葉烯 D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)、石竹烯(8.70%)、a-畢橙茄醇(7.03%)、依蘭油醇(4.83%)。