棉秸稈自然腐解過程中細菌菌群多樣性分析

王志方，陳競，代金平，古麗努爾·艾合買提，王小武，秦新政，李晨華，楊新平

( 1.新疆農科院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091；2.中科院新疆生態與地理研究所，烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】新疆是我國最大棉花主產區和重要商品棉生產基地，棉花秸稈資源豐富[1]，棉花秸稈中富含 N、P、K等多種營養元素，對資源化利用、現代農業可持續發展均具有重要意義[2]。棉秸稈木質化程度和C/N比均較高[3]，其資源化利用水平低下；新疆土地較貧瘠，若將棉秸稈直接還田，不僅在短時間內難以腐熟[3]，而且易導致C/N比失衡，引起還田秸稈在腐解前期與作物爭氮，影響土壤微生態環境[4]。大部分棉秸稈隨意堆置或原位焚燒，微生物在秸稈腐解和養分釋放過程中具有舉足輕重的作用[5]，秸稈降解微生物群落功能多樣性的研究顯得尤為重要。【前人研究進展】主坐標分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數據中提取出最主要的元素和結構。基于Weighted Unifrac距離來進行PCoA分析，如果樣品距離越接近，表示物種組成結構越相似，因此，群落結構相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會遠遠分開。秸稈發酵/腐解是多種微生物菌群共同作用的結果，并依賴于外部因素進行自我調控的復雜生化過程[6]。尉良[7]發現添加微生物菌劑能有效促進發酵過程中有機物質的分解，加快發酵腐熟進程，能在一定程度上提高發酵產品的肥效；慕永紅等[8]發現，利用MTS酵素可以加速秸稈腐爛速度，促進秸稈中營養元素的釋放，在生物菌劑的作用下，秸稈中速效磷大量釋放期可以提前一個月，以及速效鉀釋放量增加1倍[9]。目前，自然界中存在的某些細菌、放線菌和真菌等均具有降解秸稈特性，其中因放線菌和細菌產酶含量低，且二者多產生胞內酶，難于分離，故不易大規模生產。在工業生產中，主要利用Trichoderma．sp 和Aspergillus．sp 用于降解秸稈。還有研究表明，Coriolus.sp、Poria．sp、Phanerochaete.sp、Sjekandera.spPenicillium.sp 、Acremonium．sp、Myrothecium.sp、Neurospora．sp 、Chaetomium．sp等菌株對秸稈也具有較高的分解能力[10-12]。 【本研究切入點】由于秸稈腐解的快慢與秸稈自身組成、微生物種類和所處的環境有關。不同種類的秸稈其大小、C/N ,物質組成比例及周圍的環境條件各不相同，導致秸稈腐解的速度亦有差異[13]。目前關于棉秸稈降解菌群的報道較少。研究利用微生物學和分子生物學手段篩選和鑒定棉稈自然腐熟過程中的微生物菌群。【擬解決的關鍵問題】基于高通量測序技術，研究棉秸稈腐解過程中微生物菌群變化，為篩選棉秸稈高效腐熟菌劑，加快棉秸稈腐解過程，提高棉秸稈還田及基質化利用效率提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棉秸稈

于2017年分別采自新疆吐魯番棉花產區，用曼大LYS550秸桿粉碎機將棉稈粉碎成 1～2 cm長度備用。稱取自然風干棉秸稈8 kg，加入自來水拌勻至含水量為60%，堆成直徑80 cm，高度60 cm的小堆，表面覆蓋塑料布，在通風的室內進行堆制，室溫在20～28℃范圍內，間隔7 d取樣，持續采樣4次。

1.2 方 法

1.2.1 棉秸稈自然堆制過程中菌群16S rDNA高通量測序1.2.1.1 基因組DNA提取

采用 CTAB 或 SDS 方法對樣本的基因組 DNA 進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。

1.2.1.2 PCR引物設計及擴增

根據所擴增的16S區域特點，基于Illumina HiSeq測序平臺，選取16S V4區引物(515F：GTGYCAGCMGCCGCGGTAA和806R：GGACTACNVGGGTWTCTAA)，與 其它片斷組合成5’Hiseq接頭-barcode-測序引物-特異引物-3’的PCR擴增引物，使用New England Biolabs 公司的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶進行PCR擴增。擴增條件為94℃ 2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s。循環25次；72℃ 5 min。

1.2.1.3 文庫構建和高通量測序

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

1.2.2 測序數據

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對每個樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列參照Qiime(V1.7.0)構成Tags數據集，進一步過濾掉其中連續高質量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。 經過以上處理后得到的Tags需要進行去除嵌合體序列的處理，Tags序列通過(UCHIME Algorithm)與數據庫(Gold database)進行比對 檢測嵌合體序列，并最終去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據(Effective Tags)。

1.2.3 序列1.2.3.1 操作分類單元聚類和物種注釋

利用Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001)[14]對所有樣品的全部 Effective Tags進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，同時選取OTUs的代表性序列，用Mothur方法與SILVA[15]的SSUrRNA數據庫[16]進行物種注釋分析(設定閾值為0.8～1)，獲得分類學信息并分別在各個分類水平，統計各樣本的群落組成。

1.2.3.2 樣品復雜度

使用Qiime軟件(Version 1.7.0)計算Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods-coverage 指數，使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線，使用R軟件進行Alpha多樣性指數組間差異分析。

1.3 數據處理

數據均以平均值±標準偏差來表示，運用IBM SPSS Statistics 19.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 高通量測序

研究表明，5個樣品的有效序列數在6萬到9萬之間，在97%相似水平下對所有序列進行OUT劃分，OUT數量在200～600。表1

各樣品goods-coverage指數接近0.97，測序深度已經基本能覆蓋該微生物群落中絕大多數細菌。稀釋曲線可直接反映測序數據量的合理性，間接反映樣品中物種的豐富程度，當曲線趨向平坦時，測序數據量漸進合理，更多的數據量只會產生少量新的物種(OTUs)，稀釋曲線趨于平緩，結合goods coverage指數，各樣品文庫中包含了棉秸稈堆制過程中的絕大多數細菌類群，基本能夠反映群落組成，增加更多的測序數據量，只會產生很少量的新的OTU。表2,圖1

表1 棉秸稈自然腐解過程中不同時期樣品高通量測序
Table1 Data of the high-through sequencing results of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

樣品Sample有效序列總數Total number of valid sequences有效OTU總數Total number of valid OTUsD060 034216D765 857308D1472 610497D2183 071530D2872 495560

表2 棉秸稈腐解過程中不同時間樣品微生物群落α多樣性
Table 2 α diversity of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

樣品SampleGoods coverage indexShannon indexSimpson indexD00.9983.802±0.797 1c0.785 ±0.071 7 bD70.9986.386±0.330 6b0.959±0.014 1aD140.9977.384±0.140 3ab0.985 ±0.001 8aD210.9977.767±0.057 0a0.989±0.000 0aD280.9977.671±0.142 3a0.984 ±0.002 6a

注: 同列不同字母表示0.05水平差異顯著

Note: Values followed by different small letters in the same column mean significantly different atP<0.05

2.3 棉秸稈自然堆制菌群多樣性

研究表明，堆制7 d后的菌群與初期菌群結構差異明顯，而14 d后的菌群結構與7 d時也有所差異。

Alpha多樣性指數Shannon、Simpson可以用來估算微生物多樣性，數值越大，說明菌群多樣性越高，堆制7 d時細菌群落多樣性與堆制起始時有顯著性差異。堆制后期細菌群落多樣性差異不顯著。 圖2

圖1 棉秸稈自然腐解過程中不同時期樣品細菌群落稀釋曲線
Fig.1 Rarefaction curves of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

圖2 棉秸稈腐解過程中不同時間樣品微生物群落主坐標
Fig.2 PcoA of bacterial community in cotton straw samples from different degradation time

2.4 棉秸稈堆制過程中細菌優勢屬變化

堆制全過程中共測得325個菌屬，堆制初期為268個菌屬，中期達到 300個菌屬，末期菌屬為325個，比初期增加21%，堆制后期比初期微生物種類更加豐富。在全過程中始終存在的優勢菌屬有鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、橄欖球菌屬(Olivibacter)、假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、根瘤菌屬(Rhizobium)。在堆制初始階豐度最高的寡養食單孢菌屬(Stenotrophomonas)在堆制過程中持續減少。在堆制中后期成為優勢菌屬的有短波單胞菌屬(Brevundimonas)、Simiduia屬、纖維弧菌屬(Cellvibrio)。圖3

注：黃色表示細菌菌屬在腐解過程中一直是優勢菌屬；紅色表示細菌菌在屬腐解過程中豐度持續下降；藍色及紫色表示細菌菌屬腐解過程中后期成為優勢屬

圖3 棉秸稈腐解過程中不同時間樣品優勢菌屬
Table 3 Dominant bacterial genus in cotton straw samples from different degradation time

3 討 論

3.1 棉花秸稈還田具有培肥地力等優勢，由于棉秸稈主要成分為纖維素、半纖維素、木質素，還含有單寧、果膠素等，其中木質素含量為36%[17]，比其它主要農作物高2～3倍，造成棉秸稈難以充分腐解，影響播種質量、出苗、作物生長和產量。微生物降解棉稈的過程是在適宜的營養、溫度、濕度、通氣量和pH條件下，通過微生物增殖，把棉秸稈中碳、氮、磷、鉀和硫等分解礦化或形成為簡單有機物和腐殖質過程，大部分微生物只能降解其中的一部分，單一微生物所分泌的酶系統很難達到對棉秸稈的快速降解，因此，需要由多種不同降解功能的微生物協同作用來完成棉秸稈的降解。

3.2 目前采用高通量測序技術研究群落組成及變化的報道很少，主要集中在篩選一些具有降解棉秸稈纖維素、半纖維素、木質素功能的微生物菌株。孫美娜等[3]利用微生物學和分子生物學手段篩選和鑒定了棉稈表面附著的真菌，獲得4株具有高效纖維素分解能力的真菌。王益等[18]通過對白腐真菌和噬熱性側孢霉拮抗試驗、白腐真菌和噬熱性側孢霉復配對棉花秸稈降解的最優條件組合篩選試驗、白腐真菌與噬熱性側孢霉復配在田間降解秸稈的系列研究進行分析。侯敏等[19]篩選得到 24 株纖維素降解菌。詹發強等[20]從新疆棉秸稈中篩選到二株耐熱真菌，在一定培養條件下對棉秸稈的降解率為53%。但是利用傳統的培養方法選擇性很小，能夠分離到的微生物只有很小一部分，利用高通量測序技術可最大限度的保留微生物群落原有的群落組成和分布特征，可以有針對性地分離具有秸稈降解功能的土著菌。

3.3 為研究棉秸稈在自然腐解過程中菌群變化規律，采用16S rDNA高能量測序技術，對棉秸稈自然堆制過程中的分子生態學進行分析。將腐解過程按照每7 d為一個階段進行取樣分析，共持續28 d。菌群α多樣性指數分析顯示，隨著堆制時間的延長，7 d以后菌群多樣性與起始時相比差異顯著，而7～28 d菌群多樣性差異不顯著，說明在自然堆制條件下，7 d后棉秸稈中微生物群落結構進入相對穩定狀態。在整個堆制過程中始終存在的優勢菌屬包括鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、橄欖球菌屬(Olivibacter)、假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、根瘤菌屬(Rhizobium)。這些菌屬與徐麗萍等(2018)[21]、令利軍等(2017)[22]采用高通量測序技術研究降解玉米秸稈降解過程中發現的優勢菌群一致，說明這些菌屬在秸稈降解過程中起到重要作用。

3.4 菌屬功能研究表明，鞘氨醇桿菌屬、橄欖球菌屬具有降解芳香族化合物功能，假黃單胞菌屬同時具有降解芳香族化合物和纖維素功能，而木質素是一類含有氧代苯丙醇或其衍生物結構單元的芳香性高聚物[23]，推測這幾類菌屬主要作用是降解棉秸稈中的木質素和纖維素。德沃斯氏菌屬具有固氮和降解膠質多糖類物質的功能，固氮菌屬具有固氮功能。微生物對有機物降解的適宜C∶N為25∶1[24]，過高或過低均會影響微生物對秸稈的分解和秸稈養分的釋放。而棉秸稈C∶N在120∶1左右，極度缺乏氮素。推測具有固氮功能的細菌群落在堆制過程中能夠提供氮素，促進棉秸稈的降解。在堆制中后期出現的優勢菌群短波單胞菌屬 、Simiduia屬具有降解膠質多糖類物質的功能，有研究顯示，經果膠酶處理過的棉秸稈進行腐解[25]，后期的菌落總數與對照相比增長2倍， 推測此類菌群通過降解棉秸稈中的果膠類物質促進秸稈微生物群落的繁殖，促進秸稈的腐解。在堆制起始階段豐度最高的寡養食單孢菌屬隨著堆制時間延長，其豐度持續下降，隨著腐解過程的進行，棉秸稈在微生物的降解下釋放出較多的營養物質，抑制了此類菌屬的增殖。

3.5 參與棉秸稈自然腐解過程的細菌種類繁多，優勢菌群的功能集中在纖維素、木質素、果膠類物質以及固氮作用。相對真菌，細菌的降解功能較弱，在秸稈降解過程中真菌也具有重要的作用，將繼續對棉秸稈降解過程中的真菌群落進行研究，探討真菌、細菌群落的協同作用，對分離棉秸稈降解微生物菌株，制備棉秸稈高效腐熟劑。

4 結 論

4.1 棉秸稈自然腐解過程中，通過細菌群落α多樣性分析、PcoA主成分分析，顯示在7 d時細菌群落多樣性在屬水平上與腐解起始階段有顯著差異，隨著腐解時間延長，菌落多樣性趨于一致。

4.2 在整個腐熟過程中存在一些優勢屬，包括鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、橄欖球菌屬(Olivibacter)、假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、德沃斯氏菌屬(Devosia)、根瘤菌屬(Rhizobium)，為降解纖維素、木質素、果膠類物質以及提供氮素營養。