不同碳氮比對棉花黃萎病菌主要生物學性狀及致病力的影響

俞 燕，蔡夢杭，徐 燦，黃家風

(石河子大學農學院/新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區高校重點實驗室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】由大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)侵染所引起的棉花黃萎病, 每年給我國農業生產帶來經濟損失[1]。大麗輪枝菌具有寄主廣泛、變異頻繁、微菌核在土壤中存活時間長的特點，常規防治方法很難對其進行有效防治，控制黃萎病的為害，已成為當前影響棉花生產可持續發展的關鍵問題。研究外界碳氮營養比例的變化對大麗輪枝菌主要生物學性狀及致病力造成的影響，對大田生產中通過調整施肥比例，減少大麗輪枝菌對作物造成的為害有重要意義。【前人研究進展】碳(C)和氮(N)是植物必需的主要養分，碳和氮之間的相互作用調節著植物的生長發育[2]。不同C/N處理能增強煙草葉片葉綠素的合成，影響煙草的生長發育，提高光合速率，加速光合產物的積累，更好的為植株形態建成提供物質支持[3-4]。C/N對微生物生長發育也極為重要,碳氮比低時，有利于微生物在土壤中分解有機質，增加有效氮的釋放；碳氮比高時，微生物分解有機質能力受限，有效氮的釋放減少，導致微生物與植物爭奪土壤中的無機氮，從而不利于植物的生長及 NPP(凈初級生產力)的增加[5]。王瑞等[6]研究表明，不同碳氮比對少孢節叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)菌絲的生長產生明顯的影響，菌絲生長最適合的碳氮比值為5∶1，碳氮比為80∶1時，菌絲的生長率最低，隨著碳氮比值的增大，菌絲生長率下降。不同C/N對球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的產孢能力、菌絲生長量、毒力以及酶活性都有影響，在較低C/N營養條件下球孢白僵菌的產孢能力、菌絲生物量、毒力及酶活性最強[7-9]。Hoffland等[10]研究發現，番茄灰霉病(Botrytiscinerea)引起的發病率與番茄葉片碳水化合物含量及C/N比之間呈正相關關系，番茄葉片碳水化合物合成增加，葉片的C/N增加，會促進病原菌的侵染。碳氮比營養條件不僅對植物的生長有影響，對病原菌的生長繁殖及致病力也產生一定的影響。【本研究切入點】目前關于大麗輪枝菌與碳氮營養元素之間的研究，僅僅是通過觀察大麗輪枝菌在不同碳源和氮源培養基上的培養性狀，尋找大麗輪枝菌生長最適的碳源及氮源培養基[11-12]，并未研究碳氮營養元素含量的變化對大麗輪枝菌造成的影響。研究不同碳氮比營養條件對大麗輪枝菌生物學性狀及致病力造成的影響。【擬解決的關鍵問題】對培養基組分進行改進，調整查氏培養基中的C/N，記錄大麗輪枝菌的培養性狀、生長發育及致病力，分析C/N營養條件變化對大麗輪枝菌生物學性狀及致病力造成的影響，為大麗輪枝菌的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株及供試植株

棉花大麗輪枝菌落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6，分離、鑒定，經過單孢純化，于-80℃超低溫冰箱進行保存。供試植株選用對棉花黃萎病感病的品種軍棉1號和對棉花黃萎病抗病的品種中植棉2號。

1.1.2 供試培養基

根據常規的查氏培養基[13]計算出培養基中30 g蔗糖的含碳量為12.62 g，2.0 g硝酸鈉的含氮量為0.33 g[14]，含鈉量為0.54 g，試驗為減少變量因素影響，分別用含氮量為0.33 g的硝酸銨和含鈉量為0.54 g的氯化鈉替代硝酸鈉，其余的培養基成分和含量均不變。試驗中蔗糖作為唯一碳源，硝酸銨作為唯一氮源。試驗所有處理均在組分改進后的培養基中進行，各處理碳氮比(C/N)是在蔗糖一定的基礎上通過改變硝酸銨的含量進行調整的，處理分別為：處理1(CM1)：C/N為25∶1；處理2(CM2)：C/N為30∶1；處理3(CM3)：C/N為35∶1；處理4(CM4)：C/N為40∶1；處理5(CM5)：C/N為45∶1；處理6(CM6)：C/N為50∶1。

1.2 不同碳氮比營養條件下大麗輪枝菌生物學性狀的測定

1.2.1 不同碳氮比查氏固體培養基上大麗輪枝菌培養性狀的觀察

將PDA平板上培養7 d的大麗輪枝菌用打孔器取直徑5 mm的菌絲塊，分別接種于不同C/N查氏固體培養基上，置于26℃條件下黑暗培養，每隔1 d觀察菌落形態。在菌落生長的第5和第9 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落生長速度，菌落生長速度=(第9 d平均菌落直徑-第5 d平均菌落直徑)/4，并在第15 d進行拍照記錄。每個處理設5次重復，測定結果進行顯著性分析。

1.2.2 不同碳氮比查氏液體培養基對大麗輪枝菌產孢量、萌發率及菌絲量的測定

將PDA平板上培養7 d 的菌株用10 mm 的打孔器取10塊菌餅，放入查氏液體培養基中搖培3 d，用高溫滅菌過的4層紗布過濾收集分生孢子，再用無菌水調整孢子濃度至1.0×106cfu/mL。吸取100 μL孢子懸浮液，分別接種至盛有100 mL不同C/N查氏液體培養基中，26℃、200 /min搖培，分別在1 、2 、3 、4 、5 、6 d取樣進行孢子濃度的測定，每個處理設3次重復，測定結果進行顯著性分析。吸取1 mL上述搖培至第7 d的孢子懸浮液裝入2 mL的離心管中，分別在0、6、12、48、72 h觀察分生孢子萌發情況，每個處理重復3次，測定結果進行顯著性分析。然后將搖培到第7 d的菌液用濾紙過濾，將濾紙上的菌絲體轉至稱量紙上稱重(濕重)，室溫過夜或烘干，稱其重量(干重)，每個處理重復3次,測定結果進行顯著性分析。

1.3 不同碳氮比營養條件對大麗輪枝菌致病性的測定

將PDA平板上培養7 d的菌株用10 mm的打孔器取10塊菌餅，放入不同C/N查氏液體培養基中26℃，200 r/min 搖培5 d，4層紗布過濾收集各處理的分生孢子，用清水調整孢子濃度至1.0×107cfu/mL，浸根接種法接種兩葉一心期棉花幼苗[15]。開始發病后，采用5級分級法進行病情調查，病級分級標準：0級：健株；1級：子葉出現病狀；2級：1～2片真葉嚴重發病；3級：3片真葉以上表現病狀 ；4級 ：植株生長點死亡或全株枯死[12,16]；分別在10、15、20、25 d記錄病情指數，病情指數(病指)=[(1×1級發病株數)+(2×2級發病株數)+(3×3級發病株數)+(4×4級發病株數)]/[總株數×4(即最高病級)]。每個處理重復3次，測定結果取3次的平均值。

1.3 數據分析

利用SPSS軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同碳氮比查氏培養基對大麗輪枝菌培養性狀的影響

研究表明,落葉型和非落葉型2種不同致病類型的菌株形成相似的菌落形態，氣生菌絲均勻分布在菌落表面，菌落中央形成黑色微菌核，菌落生長速度無明顯差異；但2個菌株產生的微菌核存在明顯不同，非落葉型菌株I6在各處理中微菌核產量沒有差異，落葉型菌株V592形成的微菌核隨著培養基中碳氮比的增加呈現逐漸下降的趨勢，CM1和CM2處理中形成的微菌核明顯多于CM5和CM6處理中形成的微菌核。不同碳氮比營養條件明顯影響大麗輪枝菌落葉型菌株微菌核的形成，低的碳氮比(25∶1～30∶1)有利于微菌核形成，高的碳氮比(45∶1～50∶1)不利于微菌核形成。圖1

注：A：落葉型菌株V592的菌落形態，B：落葉型菌株V592的菌落生長速度；C：非落葉型菌株I6的菌落形態，D：非落葉型菌株I6的菌落生長速度 同列數據后不同小寫字母表示經Duncan檢驗差異極顯著(P< 0.05)，下同

A: Colony morphology of defoliating strain V592, B: Colony growth rate of defoliating strain V592; C: Colony morphology of non-defoliating strain I6, D: Colony growth rate of non-defoliating strain I6.The different small letters after the figure in a column mean differences extremely significant by Duncan test (P<0.05), the same as below

圖1 大麗輪枝菌在不同碳氮比查氏培養基上性狀
Fig.1 Cultural characteristics ofVerticilliumdahliaeon Czapek’s media with different C/N ratios

2.2 不同碳氮比查氏培養基對大麗輪枝菌產孢量、菌絲量及孢子萌發率的影響

研究表明，大麗輪枝菌的產孢量隨著培養時間的延長而逐漸增加，從第3 d起產孢量開始表現明顯差異。第6 d時，落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6在CM1處理中的產孢量顯著高于其它各處理的產孢量，孢子濃度分別為196.67×106cfu/mL，150.00×106cfu/mL，其次在CM2處理中的產孢量較高，孢子濃度分別為166.67×106cfu/mL ，129.56×106cfu/mL，2個菌株在CM3-CM6處理中的產孢量明顯減少。低碳氮比(25∶ 1)更有利于大麗輪枝菌產孢，當碳氮比高于35∶ 1不利于大麗輪枝菌產孢。圖2

2個菌株的菌絲濕重和菌絲干重均隨培養基中碳氮比的升高呈明顯下降趨勢，在CM1處理中的菌絲量明顯高于其它各處理中的菌絲量。碳氮比越低越有利于大麗輪枝菌菌絲生長。圖3

2個菌株都是在CM4處理中孢子萌發率最高，顯著高于其它各處理中的孢子萌發率。由此說明，不同碳氮比營養條件明顯影響大麗輪枝菌的孢子萌發，40∶ 1的碳氮比更有利于大麗輪枝菌的孢子萌發。圖4

注：A：落葉型菌株V592的產孢量；B：非落葉型菌株I6的產孢量

A: Conidial production ofdefoliating strain V592; B: Conidial production of non-defoliating strain I6

圖2 大麗輪枝菌在不同碳氮比查氏培養基上產孢量
Fig.2 Conidial productionofV.dahliaeonCzapek’smediawithdifferentC/Nratios

注：A, B：落葉型菌株V592的菌絲量；C, D：非落葉型菌株I6的菌絲量

A, B: Mycelial yield of defoliating strain V592; C, D: Mycelial yield of non-defoliating strain I6

圖3 大麗輪枝菌在不同碳氮比查氏培養基上菌絲量
Fig.3 Mycelial yield ofV.dahliaeon Czapek’s media with different C/N ratios

注：A, B：落葉型菌株V592的菌絲量；C, D：非落葉型菌株I6的菌絲量

A, B: Mycelial yield of defoliating strain V592; C, D: Mycelial yield of non-defoliating strain I6

注：A：落葉型菌株V592的分生孢子萌發率；B：非落葉型菌株I6的分生孢子萌發率

A: Conidial germination rate of defoliating strain V592; B: Conidial germination rate of non-defoliating strain I6

圖4 大麗輪枝菌在不同碳氮比查氏培養基上分生孢子萌發率
Fig.4 Conidial germination rate ofV.dahliaeon Czapek’s media with different C/N ratios

注：A：落葉型菌株V592導致發病的病情指數；B：非落葉型菌株I6導致發病的病情指數；C：接種落葉型菌株V592后第20 d 的發病癥狀；D：接種非落葉型菌株I6后第20 d 的發病癥狀

A: Disease index of cotton plants inoculated with defoliating strain V592; B: Disease index of cotton plants inoculated with non-defoliatingstrain I6; C: Disease symptoms of cotton plants infected with defoliating strain V592 at 20 dpi; Disease symptoms of cotton plants infected with non-defoliating strain I6 at 20 dpi

圖5 不同碳氮比查氏培養基培養的大麗輪枝菌在感病品種上的致病力
Fig.5 Disease severity and symptoms in susceptible cotton variety infected withV.dahliaecultured in Czapek’s media with different C/N ratios

2.3 不同碳氮比查氏培養基培養對大麗輪枝菌致病力的影響

用不同碳氮比營養條件培養大麗輪枝菌，分別接種不同抗性的棉花品種。在感病品種軍棉1號上，不同碳氮比處理的落葉型和非落葉型菌株均在接種10 d時表現發病癥狀，接種15 d后，不同處理的病情指數開始表現明顯差異，CM1和CM2處理的病情指數顯著高于其它處理的病情指數。接種25 d時，CM1和CM2處理的病株葉片萎蔫、脫落、甚至整株枯死，V592的病情指數分別高達98.05和90.37，I6的病情指數分別為93.03和84.00，而其它處理的病情指數都顯著低于CM1和CM2處理的病情指數。在感病品種上，不同碳氮比營養條件對大麗輪枝菌落葉型菌株和非落葉型菌株的致病力影響一致，低碳氮比(25:1)有利于大麗輪枝菌致病，當碳氮比高于35:1大麗輪枝菌致病力明顯減弱。圖5

在抗性品種中植棉2號上，不同碳氮比處理的2個菌株也是在接種10 d時表現發病癥狀，但是病情指數明顯低于在軍棉1號上的病情指數。從不同時段調查的病情指數來看，落葉型菌株V592和非落葉型菌株I6均在CM3處理中的病情指數最高，并且明顯高于其它處理的病情指數。在抗病品種上，只有合適的碳氮比(35∶1)才有利于大麗輪枝菌致病，碳氮比過高或過低都不利于大麗輪枝菌致病。圖6

注：A：落葉型菌株V592導致發病的病情指數；B：非落葉型菌株I6導致發病的病情指數；C：接種落葉型菌株V592后第20 d 的發病癥狀；D：接種非落葉型菌株I6后第20 d 的發病癥狀

A: Disease index of cotton plants inoculated with defoliating strain V592; B: Disease index of cotton plants inoculated with non-defoliatingstrain I6; C: Disease symptoms of cotton plants infected with defoliating strain V592 at 20 dpi; Disease symptoms of cotton plants infected with non-defoliating strain I6 at 20 dpi

圖6 不同碳氮比查氏培養基培養的大麗輪枝菌在抗病品種上的致病力
Fig.6 Disease severity and symptoms in resistant cotton variety infected withV.dahliaecultured in Czapek’s media with different C/N ratios

3 討 論

已有研究表明，大麗輪枝菌在不同氮含量培養基上形成的菌落顏色、質地無明顯區別，但對大麗輪枝菌微菌核的產生量有影響，氮元素的缺乏會使大麗輪枝菌微菌核的產生量減少[17]。研究發現，不同碳氮比營養條件對大麗輪枝菌落葉型菌株的微菌核形成有影響，低碳氮比有利于微菌核的形成，高碳氮比不利于微菌核的形成。

在少孢節叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)的研究中發現，菌絲在不同碳氮比培養基中的生長速度有明顯的變化，隨著碳氮比值的增大，菌絲生長率下降[6]。對球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的研究發現，低碳氮比的營養條件有利于菌絲的生長和孢子的形成[7]。研究結果與上述研究結果一致，不同碳氮比營養條件對大麗輪枝菌的產孢能力和菌絲生長有影響，低碳氮比有利于大麗輪枝菌的產孢和菌絲生長。

不同碳氮比營養條件對大麗輪枝菌的致病力有影響，在感病品種中，低碳氮比有利于大麗輪枝菌致病，這可能與大麗輪枝菌在低碳氮比中菌核形成，分生孢子產生，菌絲生長等繁殖能力強有關。Safavi等[8]對球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的研究發現，低C/N營養條件培養的球孢白僵菌，其毒力最強，與研究結果一致。Hoffland等[10]研究番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)發現，灰霉菌在番茄上的發病率與番茄葉片中的C/N呈正相關關系，隨著番茄葉片C/N比的增加，越有利于病原菌的侵染。上述研究結果說明，外界碳氮比的變化與寄主自身碳氮比的變化都會影響真菌的致病力。研究發現，在抗病品種中，大麗輪枝菌只有在碳氮比合適的情況下才最有利于致病，這一結果與大麗輪枝菌在感病品種中的致病力結果存在差異，造成這種差異的原因可能與抗病品種中存在一些抗性基因有關，也可能是寄主品種之間的碳氮比不同所導致的，但這種差異究竟是如何造成的，還需要進一步研究。

4 結 論

不同碳氮比營養條件對大麗輪枝菌落葉型菌株和非落葉型菌株的生長、繁殖及致病力都有影響，低碳氮比(25∶1)有利于大麗輪枝菌的菌核形成、分生孢子產生和菌絲生長，在感病品種上表現出較強致病性；高碳氮比(高于40∶1)不利于大麗輪枝菌生長、繁殖和致病。