雌二醇對高眼壓大鼠眼壓、視網膜厚度及凋亡、自噬基因表達的調節作用

郭立斌，胡運韜，何凱，王晶，許洋洋

青光眼是以眼壓升高為特征的致盲性眼病，視網膜神經節細胞凋亡和自噬過度、視網膜神經層及視神經萎縮是主要的病理特征，患者可逐步出現視野缺損、視力減退，直至失明[1-2]。高眼壓在青光眼的病情發展變化過程中起到至關重要的作用，降眼壓是臨床上治療青光眼的重要手段，在此基礎上需要保護視網膜神經節細胞以達到改善視網膜神經層厚度及視神經功能的作用，進而最大限度地保護青光眼患者的視力。雌激素不僅在女性生殖系統中發揮作用，還能在心臟、大腦等組織中發揮細胞保護作用[3-4]。已有研究報道雌激素在高眼壓動物模型中能夠減少視網膜神經節中的細胞凋亡數目[5-6]，但關于雌激素調節眼壓水平的研究結果并不一致，也缺乏雌激素對視網膜中凋亡、自噬基因表達的影響。為了進一步明確雌激素在高眼壓病理進程中的治療作用，本研究具體分析了雌二醇(E2)對高眼壓大鼠眼壓、視網膜厚度及凋亡、自噬基因表達的調節作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：SD大鼠24只,雄性, 3月齡，體質量200～250 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，許可證號SYXK2017-002，飼養溫度20～25℃、相對濕度50%～70%；經裂隙燈檢查、眼部正常、無明顯疾病。(2)試藥試劑：E2、絲裂霉素購自Sigma公司，4%多聚甲醛、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自碧云天公司，總RNA提取試劑盒、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑盒、Talent熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生物公司。(3)儀器設備：TonoLab型眼壓儀購自Tiolat公司，顯微鏡購自Nikon公司，裂隙燈購自北京拓普康醫療器械有限公司。

1.2 高眼壓模型建立 2016年3月—2018年6月在廣東省醫學實驗動物中心進行動物實驗，SD大鼠隨機數字表法分為對照組、高眼壓組、E2組，每組8只。高眼壓組和E2組大鼠予5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，再行右眼角結膜表面麻醉，在顯微鏡下剪開球結膜并對上鞏膜靜脈進行電凝閉合，同時放置浸潤了0.2 g/L的絲裂霉素C棉片。造模后第2天測定眼壓，若造模后眼壓穩定大于造模前5 mmHg則認為造模成功。對照組僅進行右眼角結膜表面麻醉，不進行其他特殊處理；E2組從造模后當天開始進行藥物干預，皮下注射100 μg/kg的E2(以植物油稀釋溶解)，隔天1次；高眼壓組給予等劑量植物油皮下注射，隔天1次。

1.3 觀測指標與方法 (1)眼壓測定：造模前及造模后1周、2周、3周、4周時，分別采用眼壓儀測定眼壓水平。(2)視網膜厚度、視神經纖維厚度測定：造模4周后，過量麻醉處死大鼠并立即摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h后進行石蠟包埋、制作病理切片。采用HE染色試劑盒對切片染色后在顯微鏡下觀察，測量視網膜厚度、視神經纖維厚度。(3)凋亡及自噬基因表達測定：取石蠟包埋的視網膜組織，采用總RNA提取試劑盒提取視網膜內RNA，采用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑盒將RNA合成為cDNA，取cDNA樣本2 μl與Talent熒光定量檢測試劑盒內的檢測液10 μl、引物0.8 μl 、去離子水7.2 μl 混合成PCR反應體系，按照95℃ 15 s、60℃ 20 s、72℃ 25 s反應40個循環，根據擴增曲線得到循環閾值(Ct)，按照公式2-ΔΔCt計算mRNA表達水平。

2 結 果

2.1 3組大鼠眼壓水平比較 造模前，3組大鼠眼壓水平比較無明顯差異(P>0.05)；與造模前比較，對照組大鼠眼壓水平無明顯變化(P>0.05)，高眼壓組和E2組造模后1～4周時眼壓水平均明顯升高(P<0.01)，且均明顯高于對照組(P<0.01)，但E2組眼壓水平與高眼壓組比較無明顯差異(P>0.05)，見表1。

2.2 3組大鼠視網膜厚度、視神經纖維厚度比較 造模后4周時，視網膜厚度、視神經纖維厚度比較，高眼壓組

表1 3組大鼠造模前后眼壓水平比較

表3 3組大鼠造模4周后視網膜中凋亡基因表達量比較

表2 3組大鼠造模后4周視網膜厚度、視神經纖維厚度比較

2.3 3組大鼠視網膜中凋亡基因表達量 造模4周后，視網膜中Bax、Caspase-9、Caspase-3的mRNA表達量比較，高眼壓組>E2組>對照組，Bcl-2的mRNA表達量高眼壓組

2.4 3組大鼠視網膜中自噬基因表達量 造模4周后，與對照組比較，高眼壓組視網膜中mTORC1、LC3-II、Beclin-1的mRNA表達量高眼壓組均明顯高于E2組高于對照組(P均<0.05) ，見表4。

表4 3組大鼠造模4周后視網膜中自噬基因表達量比較

3 討 論

高眼壓是青光眼病程中的特征，持續存在的高眼壓能夠通過引起視網膜神經節細胞的凋亡來導致視力水平減退。因此，治療青光眼不僅需要降眼壓，還需要減輕視網膜神經節細胞的凋亡。馬雪云等[5]和李貞等[6]均報道了雌激素用于高眼壓動物模型的價值，能夠減少視網膜神經節細胞的凋亡，但雌激素對高眼壓動物模型眼壓水平影響的結果并不一致，馬雪云的研究認為雌激素能夠使高眼壓動物模型的眼壓水平降低，而李貞的研究認為雌激素對高眼壓動物模型的眼壓水平無明顯影響。本研究對高眼壓組大鼠眼壓水平的分析發現：高眼壓組大鼠造模后的眼壓水平明顯高于對照組，由此提示高眼壓模型大鼠建立成功、眼壓水平明顯升高。在使用E2對高眼壓模型大鼠進行干預后發現：E2組大鼠的眼壓水平明顯高于對照組且與高眼壓組比較無明顯變化。與李貞的研究結果一致，說明E2本身并不直接影響高眼壓模型大鼠的眼壓水平、不具備直接的降眼壓作用。

青光眼病程中持續高眼壓能夠損害視網膜神經節，并逐步引起視覺功能損害、嚴重者會發生失明。在高眼壓引起視網膜神經節損害的過程中，組織學上表現為視網膜厚度及視網膜神經層厚度的丟失，這一組織學表現與視力水平下降、視野缺損的臨床表現相互吻合[7-8]。本研究對高眼壓組大鼠視網膜厚度及視神經纖維厚度的分析發現：高眼壓組的視網膜厚度及視神經纖維厚度均明顯低于對照組。E2在多種組織臟器中具有細胞保護作用，腦梗死以及脊髓壓迫模型中被證實能夠保護神經元細胞，本研究在使用E2干預后觀察了高眼壓模型大鼠視網膜厚度及視神經纖維厚度的變化，E2組的視網膜厚度及視神經纖維厚度均明顯高于高眼壓組。這一結果表明E2能夠在高眼壓過程中增加視網膜厚度及視神經纖維厚度、具有視網膜的保護作用。

在高眼壓引起視網膜內細胞凋亡的過程中，線粒體凋亡途徑是發揮關鍵作用的凋亡機制[9]。Bcl-2/Bax是一對調節線粒體途徑凋亡的上游分子，兩者能夠通過在線粒體膜上形成同源二聚體或異源二聚體的方式來影響線粒體膜對細胞色素C的通透性，Bax所形成的同源二聚體能夠促進細胞色素C的釋放，Bcl-2與Bax所形成的異源二聚體則能阻礙細胞色素C的釋放[10-11]。由線粒體釋放進入胞漿的細胞色素C能夠首先激活Caspase-9，進而通過一系列級聯放大反應來使Caspase-3激活，最終通過活化的Caspase-3來介導細胞凋亡[12-13]。本研究對視網膜中線粒體凋亡基因的分析發現：高眼壓組視網膜中Bax、Caspase-9、Caspase-3的表達量明顯升高，Bcl-2的表達量明顯降低；在用E2干預后，E2組視網膜中Bax、Caspase-9、Caspase-3的表達量明顯降低，Bcl-2的表達量明顯升高。這一結果表明高眼壓能夠激活視網膜內的線粒體途徑的凋亡，E2干預能夠調節Bcl-2/Bax、阻礙線粒體途徑的凋亡。

細胞自噬是近年來新發現的細胞死亡方式，又被稱為“Ⅱ型細胞凋亡”。在細胞經歷外界傷害性刺激的過程中，適度激活自噬能夠通過清除細胞內錯誤折疊蛋白、受損細胞器的方式來增加細胞供能，有利于細胞耐受傷害性刺激；但持續激活的自噬不僅不會為細胞供能，還會加重細胞的損傷[14-15]。mTORC1是mTOR通路中的關鍵信號分子，能夠為細胞自噬提供上游信號，通過下游Beclin1和LC3-II來促進自噬小體的形成，進而激活細胞的自噬過程并通過持續存在的自噬來引起細胞損傷[16-17]。本研究對視網膜中自噬基因的分析發現：高眼壓組視網膜中mTORC1、LC3-II、Beclin-1的表達量明顯升高；在用E2干預后，E2組視網膜中mTORC1、LC3-II、Beclin-1的表達量明顯降低。這一結果表明高眼壓能夠激活視網膜內的細胞自噬，E2干預能夠阻礙細胞自噬。

綜上所述，雌二醇雖然對高眼壓大鼠的眼壓水平無明影響，但是能夠增加視網膜及視神經纖維厚度、抑制視網膜內的細胞凋亡及自噬，因而使用E2治療青光眼能夠起到保護視網膜的作用，有利于阻礙青光眼病程中視覺的損害。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

郭立斌：負責研究設計、動物實驗及論文撰寫；胡運韜：負責研究指導、論文修改；何凱：參與動物造模及眼壓、視網膜厚度、視神經纖維厚度的測定；許洋洋、王晶：參與各基因表達的測定