CHFR基因甲基化與消化道腫瘤發生及對化療藥物敏感性的研究新進展

陳苗綜述 馮立，邢智審校

腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一，明確腫瘤的發生機制對于早期診斷和治療是極其重要的課題。目前，部分腫瘤發現時已處于晚期，因此，人們探索能在腫瘤發生的早期就能被檢測出來的標記物。經過大量研究發現CHFR(checkpoint with forkhead-associated and ring finger)蛋白在正常組織中廣泛表達，而在癌組織中表達缺失或減少，CHFR基因的缺失最初是在結直腸癌和神經母細胞瘤細胞系中被發現的，然后在食管癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌中也有報道[1-4]。而啟動子CpG 島的甲基化是導致CHFR 基因表達缺失或沉默的重要機制，由此而引發腫瘤的發生。

1 CHFR基因的結構和功能

1.1 CHFR基因的定位和結構 CHFR基因定位在染色體12q24.3，其編碼產物為含664個氨基酸的蛋白質，包含一個N-端(forkhead-associated,FHA)結構域，一個中心環指區(ring finger,RF)和一個富含半胱氨酸的C端結構域。環指區域對CHFR泛素化活性非常重要，是含鋅的蛋白質折疊，它編碼了一個E3泛素酶的家族[5]。在富含半胱氨酸的區域內，RaR-結合鋅指(PBZ)位于能夠結合聚(APP-核糖)PARP家族成員(如PARP-1)的位置。FHA區是許多轉錄因子和蛋白激酶結合DNA復制叉的特定區域，許多包含FHA區的蛋白質是細胞周期檢查點，CHFR基因同樣是一個細胞周期檢查點，因此命名為CHFR。CHFR的FHA區能識別并結合磷酸化蛋白質，它在檢查點和DNA修復蛋白質中頻繁發現[6]。

1.2 CHFR基因的生物學功能

1.2.1 CHFR蛋白是泛素化連接酶: CHFR通過泛素化連接酶的功能影響有絲分裂檢查點，該連接酶的作用不是為了降解，而是為了激活信號轉導，通過催化形成非經典Lys63-linked聚泛素化鏈[5]。最近研究發現，CHFR還可以泛素化并調控TOPK的表達[7]。TOPK是一種有絲分裂絲氨酸/蘇氨酸激酶，可磷酸化下游底物PTEN并使其失活，從而導致AKT活化。CHFR通過抑制TOPK，抑制了AKT的誘導激活，從而阻斷G2/M的進展。

1.2.2 CHFR是細胞周期檢查點: CHFR是一種早期有絲分裂檢查點基因，也是細胞啟動DNA和染色體損傷修復機制的關鍵，在控制染色體完整性方面起著重要作用[1]。有絲分裂檢查點能保證染色體正確的分配給下一代。細胞周期G2/M過渡期對各種應激都很敏感，大多數情況下并不損傷DNA，如當細胞受到放療、低溫、缺氧等刺激時，它們會激活前期檢查點，阻止細胞進入有絲分裂。事實上，該過程大部分情況下是可逆的，經過一個適應調節階段或當應激解除時，有絲分裂又重新開始。細胞短暫地停在G2末期，稱為“預前期”，有研究發現,預前期主要是由CHFR為主的途徑誘導發生的，CHFR在所有正常組織的細胞質中都有表達，在微管中毒或輻射損傷時在細胞核中積累。在定位到細胞核后，CHFR被PI3K信號通路中的蛋白激酶B(PKB/AKT)磷酸化。在細胞周期的不同階段，CHFR表達水平波動很大，微管應力將導致CHFR表達水平升高和有絲分裂抑制。相反，由AKT刺激的自氧化還原活性和CHFR降解是進入有絲分裂的先決條件[8]。因此，CHFR也控制著G2/M轉變的細胞周期進程。

1.2.3 CHFR是腫瘤抑制因子：Yu等[9]通過建立小鼠敲除模型發現，缺乏CHFR的小鼠易患癌癥，發生自發性腫瘤，該結果表明CHFR是一種腫瘤抑制因子，通過控制關鍵分裂蛋白(如Aurora A)的表達水平來確保染色體的穩定性。此外，最近的一項研究表明，CHFR除了作為腫瘤抑制因子，還在調節促炎性趨化因子白細胞介素-8(IL-8)表達方面具有額外的作用。CHFR能夠抑制NF-κB信號通路和引發后來細胞遷移及減少血管生成，失活CHFR觸發NF-κB信號活動，從而加速血管生成和轉移表型，與不良預后相關[10]。

2 CHFR甲基化與消化道腫瘤發生的關系

2000年Scolnick等[1]發現CHFR基因的表達缺失與腫瘤的發生有關，之后大量的研究對腫瘤中CHFR基因的表達進行了檢測,證實了CHFR在腫瘤中的表達缺失，同時發現了CHFR的表達沉默與啟動子區CpG島的甲基化有關。2006年 Morioka等[11]研究發現, 38例原發食管癌腫瘤組織中有9例CHFR基因啟動子區異常甲基化，而對應的正常組織沒有觀察到甲基化現象。之后Mohammed等[12]用定量RT-PCR法檢測發現，與正常食管組織相比79%的食管腺癌中CHFR轉錄物表達下調;免疫組化分析75例食管腺癌樣本，有75%的CHFR蛋白表達缺失，甲基化檢測發現31%的腫瘤樣本CHFR啟動子區DNA超甲基化，證明CHFR甲基化在食管癌組織中廣泛表達。吳書勝等[13]研究了CHFR在食管癌、食管上皮內瘤變及正常食管組織中蛋白的表達，結果發現92例食管癌組織中CHFR蛋白陽性表達率僅為7.61%，食管上皮內瘤變組織陽性表達率為54.55%，正常食管組織為96.3%；高分化的食管癌組織中蛋白的陽性表達率為33.33%，明顯高于中—低分化的食管癌組織CHFR蛋白表達陽性率的1.35%，該研究表明CHFR在食管癌中表達沉默是頻發事件，基因啟動子區異常甲基化是表達沉默的主要原因，可能與食管癌的發生發展有關，其與食管癌分化程度的關系可能更為密切。在胃癌中，2003年Satoh等[14]就對胃癌的有絲分裂檢查點基因CHFR的表觀遺傳失活進行了研究，發現20%的胃癌細胞系和39%的原發性胃癌的CHFR表達被DNA甲基化抑制。此外，未表達CHFR的細胞表現出檢查點功能受損，導致2種微管抑制劑多西他賽和紫杉醇治療后cyclin B1的核定位。表明了CHFR異常甲基化是預測胃癌對微管抑制劑敏感性的分子標記物。2016年Sepulveda等[15]研究了從非化生的胃黏膜到腸化生，從腸化生到胃癌的DNA樣本，結果顯示，CHFR在胃癌和非化生黏膜中顯著增加了CpG甲基化，并且CHFR基因的CpG甲基化水平在致癌階段逐漸增加。之后Shi等[16]對13項研究做了Meta分析，其中包括758例胃癌病例和641例對照者，結果表明CHFR的甲基化與胃癌風險的增加有顯著相關性，并且發現CHFR甲基化是胃癌的早期表觀遺傳事件。最近Ding等[17]匯集了15項研究，包括827例胃癌患者，薈萃分析數據顯示：在胃癌中，CHFR啟動子甲基化的頻率高于正常胃組織，并發現CHFR甲基化與淋巴結轉移有顯著的相關性。在結直腸癌(CRC)中，最新研究表明CHFR啟動子甲基化不僅是CRC的診斷生物標記，而且是一個預后標志。Sun等[18]匯集了7項研究包括966例結直腸癌患者，檢測癌組織CHFR啟動子甲基化的頻率與正常結腸黏膜組織相比較，結果表明癌組織中CHFR啟動子甲基化的頻率顯著增加，CHFR啟動子超甲基化與淋巴結轉移狀態也顯著相關。另外CHFR啟動子超甲基化與CRC患者的整體存活率顯著相關。Zhang等[19]在5個胰腺癌細胞系中測量了CHFR表達，在Capan1細胞中過度表達CHFR降低了增殖率，減少了細胞遷移和入侵能力。數據顯示，CHFR通過G1期阻滯來調節胰腺癌細胞的細胞周期，同時它也作為一種重要的腫瘤抑制因子在體外發揮作用，然而CHFR的過度表達并不是微管抑制劑引起的細胞凋亡的有利因素。結果表明CHFR作為胰腺癌的腫瘤抑制因子，其在控制胰腺癌細胞周期中有潛在作用。

多項研究表明，CHFR啟動子CpG島甲基化不僅可以在原發性癌癥中檢測到，在血液(NSCLC)、糞便(CRC)和腹膜液(胃癌)中也可以檢測到[20-23]。這為CHFR作為診斷標記物提供了支持。

3 CHFR甲基化與化療藥物敏感性的關系

微管靶向化療藥物如紫杉醇是最廣泛使用的一線和二線化療藥物，用于治療最常見的惡性腫瘤，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌，但對紫杉烷類的一級耐藥是常見的，并且是一個重要的臨床問題，具有叉頭和環指結構域的有絲分裂檢查點基因近年來成為抵抗微管靶向性的關鍵介質。胃癌、結腸癌、子宮內膜癌、肺癌的啟動子高甲基化或CHFR蛋白表達減少導致的表觀遺傳沉默，成為紫杉烷和多西他賽敏感性的預測生物標志物。在胃癌細胞系中， Satoh等[14]首次發現，CHFR表達與微管抑制劑敏感性降低有關。另有研究報道，在胃癌患者中，CHFR甲基化可作為多西他賽敏感標志物[24]。在結腸癌中也有研究表明，CHFR啟動子甲基化對多西他賽及吉西他濱敏感性增加[25]。CHFR啟動子CpG島甲基化在預測微管抑制劑反應中具有潛在作用。例如，宮頸腺癌細胞系中有CHFR啟動子CpG島甲基化，對多西他賽和紫杉醇治療敏感，5-Aza-2-去氧胞苷治療后CHFR表達立即恢復，對這些藥物的敏感性降低[26]。有研究分析了轉移性非小細胞肺癌中CHFR失活和紫杉醇的反應，用MSP檢測CHFR啟動子CpG島甲基化，通過甲基化微陣列驗證，免疫組織化學分析CHFR的核表達。雖然只有1/32的患者觀察到CHFR啟動子CpG島甲基化，但16/41的患者顯示出CHFR核染色減少，這表明除了啟動子CpG島甲基化外，還有一個CHFR抑制事件有待闡明。在這項研究中，與CHFR核表達升高的患者相比，核CHFR表達減少的患者治療反應更好并能延長整體生存率[27]。這些研究共同有力地支持了CHFR失活作為紫杉烷、多西他賽敏感性標記的證據。

4 結論與展望

近年來，大量試驗研究了CHFR表達失活與腫瘤發生的關系，通常是由于啟動子CpG島甲基化，可以作為預測各種癌癥微管抑制劑的預后和反應的生物標志物。大多數的研究都表明CHFR啟動子區甲基化與腫瘤的發生具有相關性，并且顯示CHFR高甲基化腫瘤細胞對紫杉醇的藥物敏感性有影響，但是一部分研究卻發現了不同的結論。 Homma等[28]研究發現，在低度惡性非侵襲性胃癌中CHFR高甲基化陽性率為10%，高度惡性非侵襲性胃癌陽性率為63%，在黏膜下侵襲性腺癌的CHFR高甲基化陽性率為35%，高度惡性非侵襲性癌的CHFR甲基化陽性率比低度惡性者高，未發現CHFR高甲基化和染色體不穩定性之間存在相關性。在小凹上皮型和普通表型的腫瘤中頻繁發現CHFR高甲基化，在完全腸道化生型中沒有發現。另外還發現高甲基化在70歲以上的患者中更為常見,并且在一些非腫瘤的老年人胃上皮中也有發現。因此，盡管CHFR甲基化與染色體不穩定性無關，但一些有凹腔或普通表型的胃腫瘤可能是CHFR年齡相關性甲基化結果。并且Yoshida等[29]回顧性分析41例胃癌患者，通過DNA亞硫酸鹽聯合限制性內切分析，檢測CHFR基因的甲基化狀態，并比較甲基化狀態對化療的敏感性，研究表明單獨CHFR基因甲基化不能預測晚期和復發性胃癌對多西他賽和紫杉醇的反應，紫杉醇和多西他賽都可能有效治療胃癌，即使CHFR表達。

CHFR基因甲基化有望作為無創的診斷腫瘤分子標記物，為了更好地應用于腫瘤中，還需進行大樣本的數據分析。以往的研究已發現CHFR高甲基化使腫瘤細胞沉默，下一步的實驗可以嘗試對于化療藥物耐藥的細胞給予促進甲基化藥物，或者進行甲基化轉染，提高腫瘤細胞對藥物的敏感性，達到抑制或治療的目的，因此，可以通過促進或抑制患者CHFR基因甲基化而成為治療腫瘤的新途徑。CHFR甲基化除了對化療藥物敏感外，在放療方面似乎也有影響，目前已在食管癌中發現它具有放射抵抗性[30]，但由于研究樣本數較少，缺乏說服力，還需進一步地研究來證實。