不同分級NSCLC病灶內FoxM1表達的變化及其與增殖、侵襲基因表達的相關性

張靜，熊琦，陶海濤，秦博宇，張國慶

非小細胞肺癌(NSCLC)是臨床最主要的原發性肺癌病理類型，近年由于體檢普及以及影像學檢查手段的革新，越來越多的小病灶NSCLC被檢出，臨床患病率呈迅速上升趨勢[1-2]。根據NSCLC病理分級不同，癌細胞的惡性程度也存在較大差異，直接影響治療方式的選擇及最終預后。低分化甚至未分化的NSCLC治療一直是臨床難點，尋找與疾病發生發展密切相關的分子靶點并進行針對性的靶向治療，成為該病治療的新思路。FoxM1是對細胞分化、器官發育等多個生命過程均具有調控作用的重要轉錄因子，已經有研究證實其可直接影響胃癌、食管癌、肝癌等常見腫瘤細胞的惡性生物學行為，推測其是癌細胞惡變過程中的重要靶點之一[3-5]。為了明確FoxM1基因在NSCLC中扮演的角色，現分析不同病理分級NSCLC病灶中FoxM1基因表達及其表達量與癌細胞增殖、侵襲等惡性行為的內在聯系，以期為日后NSCLC的靶向治療提供新思路，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年9月—2018年5月中國人民解放軍總醫院腫瘤內科接受肺癌根治術后的NSCLC患者118例作為NSCLC組，其中男56例,女62例，年齡47～72(64.37±9.15)歲; 合并高血壓35例,糖尿病21例,冠心病15例。取每個NSCLC患者的病灶組織標本作為研究樣本，根據病理分級將其分為高分化亞組49例,中分化亞組54例,低分化亞組15例。另取同期在本院進行肺結節切除術，術后病理證實為肺腺瘤的肺良性病變患者50例(病灶標本50個)作為良性組，其中男22例,女28例，年齡44～75(65.01±10.86)歲;合并高血壓14例,糖尿病8例,冠心病5例。2組患者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①NSCLC患者首次確診,且術前未經保守治療；②符合肺癌根治術指征；③嚴格無菌條件下獲取并凍存病灶組織，操作過程中無污染；④年齡18～80周歲。(2)排除標準：①合并其他原發惡性腫瘤； ②合并具有惡性生物學行為的良性疾病；③合并全身感染性疾病。

1.3 觀察指標與方法 術中病灶切除后即刻留取病灶組織標本1 cm×1 cm，置入凍存管中并放入液氮中冷凍30 min,取出后放置于-80℃冰箱長期保存。

1.3.1 FoxM1基因表達量測定： 采用實時熒光定量PCR法檢測各組病灶組織中FoxM1 mRNA表達量，具體操作步驟如下：(1)取凍存標本組織并提取樣品RNA；(2)采用紫外吸收法測定RNA質量；(3)采用反轉錄試劑盒合成樣品cDNA，反應條件包括70℃干浴3 min→冰水浴降溫至室溫→加逆轉錄酶后37℃水浴60 min→95℃干浴3 min→得到逆轉錄溶液并凍存于-80℃中；(4)待測樣品管家基因實時定量PCR，反應條件包括93℃ 2 min→93℃ 1 min→55℃ 2 min，共計40個循環；(5)DNA模板制備；(6)待測樣品FoxM1基因實時定量PCR，反應條件包括93℃ 2 min→93℃ 1 min→55℃ 1 min→72℃ 1 min→40個循環后，72℃ 7 min延伸；(7)引物序列: 5'-ATTGCGGTAGCGATGACTGAC，3'-CTAGGTACGAACCTGAGGAAT；(8)電泳明確PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。上述步驟中涉及的反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自上海西唐生物科技公司；所用試劑TRIZOL、氯仿、異丙醇、瓊脂糖、EDTA、甲醛等均購自美國Sigma公司。設置良性組病灶中FoxM1基因表達量為標準值100，計算其在NSCLC組病灶中的相對表達量。

1.3.2 NSCLC相關增殖基因、侵襲基因表達量測定：同樣采用實時熒光定量PCR法檢測NSCLC組、良性組病灶組織中增殖基因(PAX6、HOXB7、EIF5A2、DLC-1、Keap1、PTEN)和侵襲基因(PTTG1、LSD1、TEM8、KLF4、LKB1、RKIP)的mRNA表達量，具體操作步驟同1.3.1項。 上述基因的引物序列見表1。設置良性組病灶中上述基因表達量為標準值100，計算NSCLC組病灶中對應基因的相對表達量。

2 結 果

2.1 不同肺部腫瘤病灶組織中FoxM1基因表達量比較 NSCLC組病灶中FoxM1基因表達量高于良性組(P<0.01)。隨分化程度降低, FoxM1基因表達量增加，不同病理分級的病灶組織中FoxM1基因表達量比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 不同肺部腫瘤病灶組織中FoxM1基因表達量的比較

注：與高分化亞組比較，aP<0.01; 與中分化亞組比較，bP<0.01

2.2 不同肺部腫瘤病灶組織中促增殖及增殖抑制基因表達量比較 NSCLC組病灶中增殖基因PAX6、HOXB7、EIF5A2 mRNA的表達量均高于良性組，增殖抑制基因DLC-1、Keap1、PTEN mRNA的表達量均低于良性組(P<0.01)。NSCLC組中，不同病理分級的病灶組織中上述促增殖及增殖抑制基因表達量比較差異有統計學意義，且隨分化程度降低，PAX6、HOXB7、EIF5A2 mRNA的表達量增加，DLC-1、Keap1、PTEN mRNA的表達量減少(P<0.01)，見表3。

表1 NSCLC相關增殖基因、侵襲基因引物序列

表3 不同肺部腫瘤病灶組織中促增殖基因和增殖抑制基因表達量的比較

注：與高分化亞組比較，aP<0.01; 與中分化亞組比較，bP<0.01

表4 不同肺部腫瘤病灶組織中促侵襲基因和侵襲基因表達量的比較

注：與高分化亞組比較，aP<0.01; 與中分化亞組比較，bP<0.01

2.3 不同肺部腫瘤病灶組織中侵襲基因表達量比較 NSCLC組病灶中促侵襲基因PTTG1、LSD1、TEM8 mRNA的表達量高于良性組，侵襲抑制基因KLF4、LKB1、RKIP mRNA的表達量低于良性組(P<0.01)。NSCLC組中，不同病理分級的病灶組織中上述侵襲基因表達量比較有顯著差異，且隨分化程度降低，PTTG1、LSD1、TEM8 mRNA的表達量增加，KLF4、LKB1、RKIP mRNA的表達量減少(P<0.01)，見表4。

2.4 相關性分析 相關性分析發現，NSCLC病灶內FoxM1基因表達量與增殖基因PAX6、HOXB7、EIF5A2 mRNA的表達量呈正相關(r/P=0.419/0.009,0.388/0.013,0.465/0.006)，與DLC-1、Keap1、PTEN mRNA的表達量呈負相關(r/P=-0.347/0.015,-0.417/0.010,-0.503/0.000)；與侵襲基因PTTG1、LSD1、TEM8 mRNA的表達量呈正相關(r/P=0.377/0.016,0.412/0.009,0.509/0.000)，與KLF4、LKB1、RKIP mRNA的表達量呈負相關(r/P=-0.453/0.003,-0.409/0.010,-0.386/0.019)。

3 討 論

FoxM1基因屬于轉錄因子家族成員，其在胚胎組織中呈普遍表達、可刺激細胞增殖及有絲分裂，但生理狀態下在終末分化的細胞中表達量顯著下降[6]。近來研究發現，FoxM1基因的異常激活參與了許多惡性腫瘤的發生發展，同時可使腫瘤臨床分期增高、浸潤程度增加[7-8]。NSCLC已經成為臨床最多見的惡性腫瘤性疾病之一，其發展過程中的關鍵分子靶點尋找也是疾病研究的最重要課題之一。本研究中NSCLC病灶組織中FoxM1基因表達量大幅高于肺部良性疾病病灶組織，說明FoxM1基因激活也參與NSCLC的發生；同時隨NSCLC病理分化程度下降，FoxM1基因表達量呈持續上升趨勢，說明FoxM1基因表達上升是導致NSCLC惡性程度增加的直接因素之一。

癌細胞的增殖活性是反映腫瘤惡性程度最直觀的指標，檢測具體增殖基因表達量可間接反映癌細胞的增殖活力以及腫瘤惡性程度。PAX6、HOXB7、EIF5A2基因在不同研究中被證實可促進NSCLC細胞增殖[9-11]，具體與其加速細胞周期進展直接相關，在腫瘤病灶中普遍存在過表達；而DLC-1、Keap1、PTEN基因則可抑制NSCLC細胞增殖[12-14]，在具體癌癥病灶中可發現其表達異常下調。本研究發現NSCLC病灶中PAX6、HOXB7、EIF5A2基因表達量大幅高于肺部良性病灶，而DLC-1、Keap1、PTEN基因表達量則較低，且在 NSCLC病灶內部，隨腫瘤分化程度下降，上述基因表達量的變化趨勢更為顯著，與既往研究結論基本一致，說明NSCLC細胞存在異常增殖，且隨病理分級下降這一異常增殖現狀加劇，符合癌細胞的惡性行為學特征。相關性分析指出，NSCLC病灶中FoxM1基因表達量與PAX6、HOXB7、EIF5A2基因表達量呈正相關，與DLC-1、Keap1、PTEN基因表達量呈負相關，結合各個基因對癌細胞增殖的作用，可證實FoxM1基因通過促進癌細胞的增殖能力而參與NSCLC病情進展。

與細胞增殖活力相似，癌細胞侵襲性的獲得是腫瘤發生淋巴及遠處轉移的基礎，其中伴隨著多種與侵襲基因的表達變化[15-16]。PTTG1、LSD1、TEM8基因在不同研究中被證實可促進NSCLC細胞的侵襲能力[17-19]，具體與其促進細胞上皮間質轉化過程相關；而KLF4、LKB1、RKIP基因則屬于典型的抑癌基因，在惡性腫瘤組織中呈低表達甚至表達缺失[20-22]，由于其對癌細胞的惡性行為抑制不足從而間接促進腫瘤進展。本研究發現NSCLC病灶中PTTG1、LSD1、TEM8基因表達量呈異常增加，而KLF4、LKB1、RKIP基因表達量異常下降，且隨腫瘤病理分化程度下降上述基因表達量變化程度更顯著，明確了NSCLC細胞侵襲力的變化趨勢。相關性分析進一步指出，NSCLC病灶中FoxM1基因表達量與PTTG1、LSD1、TEM8基因表達量呈正相關，與KLF4、LKB1、RKIP基因表達量呈負相關，證實FoxM1基因還可以通過促進癌細胞的侵襲能力而參與NSCLC病情進展。

綜上所述， NSCLC病灶內FoxM1基因表達量異常增加，且隨病理分化程度下降其表達量進一步上升。FoxM1基因表達量與NSCLC相關增殖及侵襲基因表達量直接相關，可能由此參與疾病的發生發展。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

張靜:負責研究構思、選擇課題、課題設計、論文撰寫；熊琦、陶海濤、秦博宇:負責數據獲取、統計分析并參與撰寫；張國慶:負責研究方案指導、論文修改